非小细胞肺癌与结直肠癌KRAS突变分析

郑神英，李 宁

(1.河北北方学院，河北张家口075000;2.解放军总参谋部总医院病理科，北京100091)

肺癌和结直肠癌都是很常见、发病率很高的恶性肿瘤。肺癌目前是全世界癌症死因的第1名，其中80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)［1］。结直肠癌是癌症死亡的第3大原因，每年几乎有100万例的发病率，无论在男性还是女性［2］。由于很多患者在诊断时已经处于中晚期，常规治疗往往不能达到预期效果。随着分子靶向药物的研发和个体化治疗的发展，使得癌症患者的治疗有了很大改善，如酪氨酸激酶抑制剂的应用。KRAS基因与肺癌和结直肠癌的发生发展有着密切的关系，同时KRAS突变是所有肿瘤中突变频率最高的基因，因此成为研究的焦点。KRAS基因是EGFR的下游因子，若基因发生突变，则患者不能从酪氨酸激酶抑制剂中获益。因此KRAS的突变成为靶向治疗的关键。本研究用测序法检测非小细胞肺癌和结直肠癌中KRAS的突变情况，研究其与临床病理特征之间的关系，并横向比较KRAS基因突变在两种癌症间的异同。

1 材料与方法

1.1 材料:收集解放军总参谋部总医院病理科2010年至2011年间存档标本或新鲜标本，其中非小细胞肺癌112例，结直肠癌65例。

1.2 KRAS基因突变检测:所有蜡块切4 μm厚切片5～10张，显微镜下进行微切割，富集肿瘤细胞，石蜡组织充分消化后用Nucleic Acid and Protein Purification试剂盒(MN公司)提取DNA。将提取的基因组DNA应用PCR扩增法，分别扩增KRAS第12、13和61密码子，引物序列:第12号密码子上游引物(F):5'-ACCTTATGTGTGACATGTTC-3'，下游引物(R):5'-CTATTGTTGGATCATATTCG-3';第13号密码子上游引物(F):5'-ACCTTATGTGTGACATGTTC-3'，下游引物(R):5'-CTATTGTTGGATCATATTCG-3';第61号密码子上游引物(F):5'-TTCCTACAGGAAGCAAGTAG-3'，下游引物(R):5'-CACAAAGAAAGCCCTCCCCA-3'。PCR扩增产物纯化后用ABI 3730测序仪进行双向测序，测序结果采用Chromas软件进行分析。

1.3 统计学分析:应用SPSS软件17.0，应用卡方检验及Fisher精确概率法评价KRAS基因突变率与潜在影响因素的关系。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌临床资料:112病例均成功检测。男性73例，女性39例;年龄28～86岁，中位年龄60岁;有吸烟史患者63例，无吸烟史患者49例;组织学证实腺癌70例，非腺癌42例。

2.2 结直肠癌临床资料:65例病例均成功检测。男性36例，女性29例;年龄32～86岁，中位年龄59岁;有吸烟史12例，无吸烟史53例;肝转移7例，无转移58例;淋巴结转移18例，无转移47例;脉管浸润18例，无浸润47例。

2.3 KRAS基因在非小细胞肺癌中突变情况:112例患者中检出11例突变，突变率为9.8%。其中8例为第12密码子突变，占72.7%;1例为第13密码子突变，占9.1%;2例为第61密码子突变，占18.2%。第12密码子中GGT＞GTT 3例，GGT＞TGT 2例，GGT＞GCT 3例;第13密码子中GGC＞TGC 1例;第61密码子CAA＞CAC 1例，CAA＞CTA 1例。

2.4 KRAS基因在结直肠癌中突变情况:65例患者中检出19例突变，突变率为29.2%。其中16例为第12密码子突变，占84.2%;1例为第13密码子突变，占5.26%;2例为第61密码子突变，占10.5%。第12密码子中GGT＞GAT 12例，GGT＞TGT 1例，GGT＞GTT 3例;第13密码子中GGC＞GAC 1例;第61密码子CAA＞CGA 2例。

2.5 KRAS基因突变与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系:KRAS突变与患者性别、年龄、吸烟史及肿瘤类型均无明显关系(表1)。

2.6 KRAS基因突变与结直肠癌患者临床病理特征的关系:KRAS突变与患者性别、吸烟史、是否肝转移、淋巴结转移和血管浸润均无明显关系，但与患者年龄明显相关(P＜0.05)(表2)。

表1 NSCLC组织KRAS突变检测与临床参数的关系Table 1 The correlation between KRAS mutation and clinical parameter in NSCLC

3 讨论

随着肿瘤个体化治疗观念深入人心，越来越多的基因突变点检测应用于临床。KRAS突变在肺癌和结直肠癌中均很常见，其与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移、扩散和血管生成均有关系。KRAS突变和NSCLC不良预后有关，是一个独立于分期影响生存的因素［3］。KRAS是EGFR下游的重要分子，KRAS突变和EGFR突变相互排斥，与原发性EGFR-TKIs耐药相关。

对于KRAS基因突变与临床病理特征之间的关系尚没有达成一致，而且相关报道也不尽相同。KRAS基因突变在肺腺癌中与男性和吸烟有关。KRAS突变与吸烟史有关，且突变率随着吸烟暴露史的增加而升高。但在本次检测中没有发现肺癌中KRAS基因突变与吸烟有关。KRAS基因在结直肠癌大于60岁女性人群中突变率较高。KRAS基因突变与结直肠癌淋巴结转移和肝转移密切相关。本次对结直肠癌的检测中，仅发现与年龄相关，分析可能与病例较少有关。

表2 结直肠癌组织KRAS突变检测与临床参数的关系Table 2 The correlation between KRAS mutation and clinical parameter in colorectal cancer

综上，结直肠癌患者的KRAS基因突变率比肺癌患者高。无论在肺癌还是结直肠癌中，KRAS基因突变都以第12密码子为主。结直肠癌中KRAS突变与年龄相关。KRAS基因突变与临床病理特征之间的关系尚需更多的研究来进一步确定。

［1］李雪，李建鹏，哈鹏文．Stathmin在非小细胞肺癌中表达增强［J］．基础医学与临床，2011，31:1115 －1119．

［2］Sergio R，Giuseppe B，Daniele F，et al．Prognostic vs predictive molecular biomarkers in colorectal cancer:is KRAS and BRAF wild type status required anti-EGFR therapy［J］．Cancer Treat Rev，2010，36:S56 － S61．

［3］付鲜花，黄建瑾．非小细胞肺癌中KRAS基因突变最新临床意义［J］．基础医学与临床，2010，30:212 －214．