微波辅助提取枳壳中柚皮苷、新橙皮苷的工艺研究

刘学仁， 蔡品品， 姜 涛， 向显智， 吕鉴泉*

(1.湖北省黄冈市食品药品监督检验中心，湖北 黄冈 438000;2.湖北师范学院化学与环境工程学院，湖北黄石 435002)

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种干燥未成熟果实。枳壳性微寒，味苦、辛、酸、温，入脾、胃经。具有理气宽中，行气消滞等功能;用于胸肋气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停，胃下垂，脱肛，子宫脱垂等症。枳壳中化学成分主要有黄酮类、挥发油及少量生物碱等，其中黄酮类成分中又以柚皮苷 (Naringin)和新橙皮苷 (Neohesperidin)等成分，是枳壳理气、行滞、祛痰和平喘的主要药理成分。柚皮苷和新橙皮苷具有广泛的生物活性和药理作用，能调节和干预心血管系统、神经系统、内分泌系统等系统的生理功能和病理变化，也具有抗肿瘤、抗基因突变、抗菌和微生物、抗炎和抗过敏等作用;可以通过竞争性抑制来提高其他药物的生物利用度，等等［1］。

目前对枳壳黄酮类成分提取和分离方法研究，主要有水浴回流提取法［2］、醇或碱液提酸沉法［3］、索氏提取法［4］、超声辅助提取法［5］和超临界流体萃取法［6］等方法。这些提取和分离方法也各有优点，但同时也存在或耗能、耗时、耗溶剂，或产率不高，或设备要求高等缺点。采取微波辐射进行提取分离，可以克服上述缺点，同时具有效率高、选择性强、节省时间、节省溶剂、节能、污染小等优点，目前已应用到包括黄酮在内的几大类天然化合物的提取与分离［7-8］。本实验在前人研究的基础上，采取在常压条件下用微波萃取枳壳中的柚皮苷和新橙皮苷，考察溶剂、微波萃取功率、提取时间、温度等因素对枳壳中柚皮苷、新橙皮苷提取效果的影响，找出最佳提取工艺条件，为枳壳中黄酮成分的提取分离提供实验依据。

1 仪器与试剂

DIONEX型高效液相色谱仪 (Dionex戴安仪器公司)，包括P680高压泵、PDA—100检测器、TCC—100柱温箱、ASI—100自动进样器。XH—100A微波催化合成/萃取仪(北京市祥鹄科技发展有限公司);SartoriusCP225D十万分之一电子分析天平;AB104—N型电子分析天平。

对照品柚皮苷 (中国药品生物制品检定所，批号110722-200620，纯度100%)、新橙皮苷 (西安旭煌技术有限公司，批号N-100302，纯度98%)。液相用乙腈、甲醇均为色谱纯，提取用甲醇为分析纯，水为超纯水。

枳壳样品购于安徽亳州药材专业市场。

2 实验方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件 Dikma C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);乙腈-水 (20∶80)(用磷酸调节pH至3)为流动相;进样体积20 μL;检测波长283 nm;柱温30℃;体积流量1.0 mL/min。

2.1.2 标准品溶液的制备 分别精密称取减压干燥至恒定质量的柚皮苷和新橙皮苷标准品各3.0 mg，置25.00 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得分别含柚皮苷和新橙皮苷120 μg/mL的标准溶液。使用时，精密取5.00 mL标准溶液于10.00 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得分别含柚皮苷和新橙皮苷60 μg/mL工作溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取枳壳样品粗粉0.2 g，置于100 mL三颈烧瓶中，精密加入相应的溶剂50.00 mL，密塞，称定质量。将三颈烧瓶放入微波炉腔室中，接好装置，接通冷凝水，设置各参数，开启微波。萃取完成后，取出三颈烧瓶放置至室温，称定质量，用相应的溶剂补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 分别取1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL柚皮苷和新橙皮苷的工作溶液注入高效液相色谱仪中，进行色谱分析。以进样质量对峰面积进行线性回归，作出校正曲线。柚皮苷标准曲线方程为:Y=28.217X－0.381 7(r=0.997 8，n=5)，线性范围为0.062 8×10－6～1.256×10－6g;新橙皮苷标准曲线方程为:Y=32.922X－0.269 0， (r=0.999 4，n=5)，线性范围为0.072 4×10－6～1.448 0×10－6g。见图1。

图1 枳壳 (A)、新橙皮苷 (B)、柚皮苷 (C)HPLC色谱图

2.2.2 精密度试验 分别吸取柚皮苷和新橙皮苷的工作溶液各20 μL，按上述色谱条件，分别进样6次，测定峰面积，柚皮苷的RSD值为0.8%(n=6);新橙皮苷的RSD值为0.9%(n=6)。结果表明，此方法精密度良好。

2.2.3 重复性试验 精密称样品粗粉0.1 g共6份，按2.1.3项供试品溶液的制备方法制备供试品，按上述色谱条件，每份分别进样2次进行测定。测定该枳壳样品中含柚皮苷平均质量分数4.32%，RSD值为1.1%(n=6);含新橙皮苷平均质量分数为2.48%，RSD值为1.3%(n=6)。表明本方法重现性较好。

2.2.4 稳定性试验 精密取枳壳样品0.152 8 g，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别吸取同一供试品溶液20 μL，按上述色谱条件，分别在0、1、6、12、18、24 h进样测定。测定峰面积，柚皮苷平均质量分数为4.27%，RSD值为0.9% (n=6);新橙皮苷平均质量分数为2.33%，RSD值为0.5%(n=6)。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收试验 精密称取已测定 (含柚皮苷和新橙皮苷分别约为4.32%和2.48%)的枳壳样品粗粉约0.1 g共6份，在每一份中分别加入标准品柚皮苷约4.8 mg和新橙皮苷约2.5 mg，按2.1.3项供试品溶液的制备方法制备供试品，按上述色谱条件，分别取20 μL进样，照样品测定项下进行测定。测定该枳壳样品中加样回收率柚皮苷为92.7%，RSD值为2.0%(n=6);新橙皮苷为88.7%，RSD值为2.3%(n=6)。表明本方法准确度较好。

表1 加样回收试验 (n=6)

2.3 样品的测定

2.3.1 萃取条件的正交优化 选取溶剂、微波萃取仪功率、提取时间和提取温度为考察因素，以测得的柚皮苷和新橙皮苷量为考察指标，进行4因素3水平正交实验L9(34)，选取最佳提取工艺参数。因素水平设计见表2。

表2 正交实验因素水平L9(34)

2.3.2 测定结果与分析 正交实验9个实验，每个实验分别进行2次平行实验，共取枳壳样品18个，每个样品取枳壳粗粉约0.2 g，以3个样品为一组，按2.1.3项供试品溶液的制备和正交实验设计的相应条件分别进行处理、测定每组柚皮苷和新橙皮苷的量的平均值。测定结果及结果分析见表3。

由表3可知各实验因素及其因素水平对枳壳中柚皮苷和新橙皮苷的提取量大小的影响表现出一定的差异。无论是对柚皮苷还是新橙皮苷的提取，4因素的极差R值的大小排序基本为A＞B＞D＞C;而且4个因素中，溶剂因素的影响远远大于其他3个因素的影响。提取的优化条件为:80%乙醇作溶剂，微波萃取仪功率400 W，时间10 min，温度40℃，即A2B2C2D2。同时就极差R大小来看，各实验因素及其因素水平对柚皮苷的提取影响比对新橙皮苷的影响更大。分析其可能的原因，一是可能柚皮苷和新橙皮苷在微波作用下热稳定性不同;另一个可能的原因是两者的溶解度有一定的差异。

用方差分析对实验结果进行验证，考察其显著性，分析结果见表4。

以柚皮苷为考察对象，误差为最小的离差平方和0.54，自由度为2+2=4，F0.05(2，4)=6.94。由表6可知，FA=7.69＞F0.05(2，4)=6.94，所用溶剂为显著影响因素;F0.05(2，4)=6.94＞FB=1.24＞FD=1.15＞FC=1.00，微波萃取仪功率、萃取时间、萃取温度均为不显著因素。以新橙皮苷为考察对象，由表4可知，误差为最小的离差平方和0.08，自由度为 2+2=4，F0.05(2，4)=6.94;FA=9.50＞F0.05(2，4)=6.94;F0.05(2，4)=6.94 ＞FB=1.62 ＞FD=1.50＞FC=1.00，也得到所用溶剂为显著影响因素，微波萃取仪功率、萃取时间、萃取温度均为不显著因素。从方差的观点来看，无论是对柚皮苷还是对新橙皮苷，微波辅助提取的优化条件均为A2B2C2D2，即80%乙醇作溶剂，微波萃取仪功率400 W，时间10 min，温度40℃;只是各因素对柚皮苷和新橙皮苷影响的程度有一定的差别。分析其原因可以得到与直观分析一致的结论。

表3 正交实验结果及结果分析

表4 方差分析

3 结论

本实验采用微波辅助提取的方法，对枳壳中柚皮苷和新橙皮苷提取条件进行了研究。实验结果表明，无论是对柚皮苷还是新橙皮苷，微波提取的优化工艺条件是:80%乙醇作溶剂，微波萃取仪功率400 W，提取时间10 min，提取温度40℃。与回流提取法的2 h相比，提取时间大大缩短，效率有了明显的提高。与索氏提取、超声辅助提取等方法比，也降低了提取温度，保证了黄酮成分热稳定性的要求;同时优选80%乙醇作提取溶剂，可以降低其他有机溶剂残留毒性。与文献比较［9］，所获得的优化工艺条件有的参数是相同的，也有些参数有一定的差别，这是由于实验设置的因素和水平不同所致。本实验同时考察枳壳中成分量比较高的两种成分，更能反映优化工艺条件的意义。此方法简便、准确、可靠、快速、实用，对正确评价枳壳中黄酮成分的内在品质以及芸香科其他天然药物中功能性成分的提取、分离及分析方法的建立具有一定的参考与借鉴作用。

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