蒙药瑞香狼毒及其奶制品中新狼毒素甲、瑞香素乙、新狼毒素乙的比较研究

吴七十三， 王青虎*， 刘 瑛， 代那音台

(1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古通辽 028000;2.通辽市高级技工学校，内蒙古通辽 028000)

瑞香狼毒，蒙名为达琳图日古，系瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒Stellera chamaejasmeLimt的干燥根，具有峻泻，杀“粘”，消“奇哈”，止腐，消肿之功效。临床用于肌、骨、脉“奇哈”症，丹毒，乳痈，腮肿 (腮腺炎)，黄水疮，痘疮［1］。在我国大部分地区均有野生，广泛分布于西北、内蒙古、黑龙江等地。《晶珠本草》［2］、《蒙药正典》［3］、《中国医学百科全书·蒙医学》［4］、 《识药学》［5］认为瑞香狼毒是瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒Stellera chamaejasmeLimt的干燥根，对形态和功效的描述与《蒙药学》、《内蒙古蒙药材标准》所记载的相同。文献报道瑞香狼毒主要的活性成分有黄酮类［6-9］、二萜 类［10］、香豆 素 类［11-15］以 及 木 脂 素类［16-17］等化合物。瑞香狼毒总黄酮提取物具有较强的体内和体外抗肿瘤作用［18］，同时也是瑞香狼毒的主要有毒成分［19］，所以在传统炮制的过程中，为减少有效成分的损失，降低毒性，中医以醋炙的方法进行炮制［20］，而蒙医一直都有瑞香狼毒牛奶炮制、酒制和诃子汤炮制［21］的应用，而且取得了显著的成效。王晋等［22］提出瑞香狼毒奶制后毒性下降，但依然保持了良好的疗效。查阅文献，尚未见有对其有效成分和毒性成分多指标成分同时定量分析的报道，故本实验以新狼毒素甲、瑞香素乙、新狼毒素乙为指标成分，建立了HPLC同时测定方法并对瑞香狼毒及其奶制品中3种即为有效成分又是毒性成分进行了比较。

1 实验材料

1.1 仪器 AUW220D型电子天平 (日本岛津);HH—S26S型水浴锅 (金坛市大地自动化仪器厂);RE52—2型旋转蒸发器 (上海泸西分析仪器厂);KQ—100型系列超声波冲洗器 (昆山市超声仪器有限公司);UV—2501PC型分光光度计 (日本岛津);高效液相色谱仪 (LC10—Atvp输液泵，SPD—M10Avp检 测 器，SCL—10Avp工 作 站，DGU—12A脱气机)。

1.2 试药 瑞香狼毒采集于内蒙古呼盟，由内蒙古民族大学蒙医药学院蒙药生药教研室布和巴特尔教授鉴定为瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒Stellera chamaejasmeLimt的干燥根。新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙均自制并用高效液相色谱仪分别测定其纯度均高于98.5%，可作为对照品使用;甲醇为色谱纯 (天津市光复精细化工研究所);水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 大连依利特hypersil ODS2柱(300 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇和水梯度洗脱，梯度程序见表1;检测波长293 nm;体积流量1.0 mL/min。在上述色谱条件下，新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙达到基线分离 (R＞1.5)，理论塔板数均不低于4 000，分离色谱图见图1。

表1 梯度程序Tab.1 Gradient elution program

图1 样品溶液 (A)和混合对照品溶液 (B)色谱图Fig.1 Chromatograms of sample solution(A)and mixed reference substances(B)

2.2 炮制品的制备 取瑞香狼毒 (采集时间20100826)20 g，切成宽度约0.5 cm，放入烧杯中，加牛奶80 mL，浸泡5 h，加热沸腾20 min，然后60℃烘干5.5 h，取出备用［22］。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，分别配成6.0 mg/mL的贮备液。

2.3.2 供试品溶液的制备 瑞香狼毒及其炮制品研细，称取粗粉0.1 g，精密称定，加甲醇25 mL，称定质量，超声30 min，放冷，用甲醇补充失质量，过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 检测波长的选择 分别取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的对照液，在200～400 nm内，进行扫描，根据扫描图谱分析，确定新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的检测波长为293 nm。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙对照品贮备液适量，分别加甲醇配制成5个不同质量浓度的系列对照溶液。分别取上述溶液5 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程和线性范围，结果见表2。

表2 3种有效成分的回归方程式和最低检测限Tab.2 Regression equation and detection limit of three effective components

2.4.3 最低检测限 (LOQ) 取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙对照品溶液以不同比例稀释后测定，以信噪比2～3为最低检出，结果见表2。

2.4.4 精密度试验 分别取同一新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的对照品液，在上述色谱条件下，连续进样6次，测定峰面积。计算新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的峰面积RSD，分别为0.98%、1.05%和0.89%。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、4、6、8、12 h依法测定，以峰面积值计算新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的峰面积RSD分别为1.22%、1.43%和1.12%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.4.6 重复性试验 取同一采集时间的样品6份，制备供试品溶液，进行测定，计算新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的质量分数，其RSD分别1.33%、1.29%和1.02%。

2.4.7 回收率试验 精密称取样品 (采集时间为20100826)0.05 g，6份，精密加入新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙适量，制备供试品溶液，测定，计算加样回收率和RSD，结果见表3。

表3 回收率测定结果 (n=6)Tab.3 Results of recoveries(n=6)

2.5 样品测定 精密吸取3个不同采集时间的样品供试品溶液和炮制品溶液3份，每份5 μL，进样测定，计算样品中新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的质量分数，结果见表4。

表4 测定结果 (n=5)Tab.4 Determination results(n=5)

3 讨论

3.1 黄酮类成分是瑞香狼毒中含有量较大的一类成分，具有较强的体内和体外抗肿瘤作用，也是主要有毒成分。瑞香狼毒牛奶炮制是现代蒙医临床上常用的炮制方法，经文献查阅，尚未见关于奶制对瑞香狼毒中黄酮类化合物影响的报道，故本实验应用HPLC建立了同时测定3个即为有效成分又是毒性成分的方法，对比了瑞香狼毒生品、奶制品中3个指标成分的含有量差别，从而探讨瑞香狼毒奶制对黄酮类成分的影响和减毒的机理。结果显示，奶制对瑞香狼毒黄酮类成分影响明显。其中，新狼毒素甲、瑞香素乙的含有量明显降低，新狼毒素乙检测不到。这说明牛奶炮制可降低瑞香狼毒中毒性成分，提高安全性。关于牛奶炮制能降低瑞香狼毒中黄酮类成分的原因有待于进一步研究。

3.2 在流动相选择中，曾采用甲醇-水的不同梯度洗脱系统，结果甲醇-水梯度洗脱 (0～10 min，甲醇比例为28%递升至45%，10～20 min，由甲醇腈比例45%递升至65%，20～30 min，甲醇比例由65%递升至 755%，30～40 min，甲醇比例为75%)，分离效果好，重现性强，可同时检测到新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙且各成分均达到基线分离。经紫外扫描可知，新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙均在261和293 nm处有最大吸收，并且293 nm吸收强度强，故选择293 nm为检测波长。

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