金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠TLR7 mRNA和蛋白表达的影响

戴启刚， 汪受传， 徐建亚， 李佳曦， 梁晓鑫， 李 涛， 孙寒丹

(南京中医药大学中医儿科研究所，江苏南京 210029)

呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus，RSV)感染呼吸道后通过诱导上皮细胞分泌细胞因子、趋化因子等炎性介质，引起支气管痉挛产生气道高反应［1］，是世界范围内婴幼儿病毒性下呼吸道感染最主要的病毒病原，中医药治疗RSV感染有良好的临床疗效。前期临床和实验研究显示金欣口服液 (原名清肺口服液)是治疗小儿病毒性肺炎的有效中药制剂［2］，有拮抗RSV作用［3-5］。现代相关研究已证实Toll样受体 (Toll-like receptor，TLRs)与RSV感染密切相关［6］，TLRs介导的信号通路既可激活天然免疫又可调节获得性免疫，参与天然免疫系统对病毒的识别，在抗病毒感染中发挥了重要的作用［7-9］。目前已经发现13个TLRs成员，TLR7是与RSV关系最为密切的TLRs之一［10］。TLR7通过识别病毒单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)以依赖髓样分化因子-88(MyD88)的信号通路活化免疫细胞，介导抗病毒免疫。

本实验以RSV感染BALB/c小鼠引发肺炎，观察小鼠肺组织中TLR7 mRNA、蛋白表达及金欣口服液对它们的作用，探讨金欣口服液可能的抗病毒作用机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级 BALB/c小鼠，8～10周龄，雌性，18～22 g，扬州大学比较医学中心，许可证号:SCXK(苏)2007-0001，饲养于南京中医药大学实验动物中心;呼吸道合胞病毒A亚型 (Long株)，武汉国家典型培养物保藏中心。

1.2 药品 金欣口服液 (浸膏):全国名老中医、南京中医药大学中医儿科研究所所长汪受传教授经验方，由炙麻黄3 g、苦杏仁10 g、生石膏20 g、黄芩6 g、葶苈子10 g、桑白皮10 g、前胡10 g、虎杖12 g组成，按比例取药，用10倍量水浸泡药物30 min，先煎生石膏30 min后，再将其他药放入大火煮沸后小火煎煮30 min，取出药汁，药材中再加入8倍量水依上法煎煮，合并两次药汁用旋转蒸发仪低压浓缩为质量浓度为1.351 g/L的金欣口服液;利巴韦林颗粒 (新博林)，50 mg/包，四川百利药业有限责任公司，国药准字H51023508，批号110647。

1.3 主要仪器 电泳槽、Trans-Blot_SD半干转印槽，美国Bio-rad;超低温冰箱，美国Theromo公司;BioPhotometer蛋白核酸分析仪、MJ mini梯度PCR仪、高速台式冷冻离心机、面包式离心机、移液枪，德国Eppendorf公司;漩涡振荡器、水平摇床，江苏海门麒麟医用仪器厂;电子天平，上海天平仪器厂;制冰机，美国Scotsman公司;Lightrcycler实时荧光定量PCR仪，德国Roche公司。

1.4 主要试剂 RNA提取试剂盒RNAiso plus、实时荧光定量PCR试剂盒，日本TAKARA公司;TLR7引物，上海生工生物技术有限公司;β-Actin抗体、羊抗兔HRP标志二抗，美国CST公司;TLR7多克隆抗体，美国abcam公司;蛋白裂解液RIPA(增强型)、PMSF，碧云天生物技术有限公司;TRIS base、甘氨酸，北京索莱宝公司;光明牌脱脂奶粉，光明乳业有限公司;5倍上样缓冲液、预染蛋白分子质量标准Marker(10～170 kDa)，南京生兴生物技术有限公司;29∶1丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺混合物 (Acr-Bis)、10%十二烷基磺酸钠 (SDS)、过硫酸铵 (AP)，美国伯乐;PVDF膜 (0.45 μm孔径)，Millipore;封口膜，Parafilm;胶片，柯达公司;余为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 动物分组 选用清洁级健康BALB/c小鼠，8～10周龄，雌性，18～22 g。动物分两大组:72 h组 (RSV首次滴鼻72 h后采集标本)、144 h组 (RSV首次滴鼻144 h后采集标本);每大组又分为5小组，正常组、RSV感染模型组、利巴韦林组、金欣高剂量组、金欣等效剂量组。每组15只小鼠。利巴韦林组给予临床等效剂量46 mg/(kg·d)，金欣等效剂量组给予临床等效剂量27.6 g/(kg·d)，金欣高剂量组给药138 g/(kg·d)(相当于临床等效剂量的5倍)。药物实验组每日剂量分2次灌胃，正常组与RSV组灌胃同等剂量的生理盐水。

2.2 造模及给药方式 健康BALB/c小鼠于无病原体环境中常规饲养3 d后开始正式实验。行乙醚浅麻后滴鼻TCID50RSV 50 μL/只 (正常组滴鼻同体积无血清DMEM培养基)，每天滴鼻2 h后给相应药物灌胃，72 h组RSV滴鼻3 d、灌胃3 d，144 h组RSV滴鼻3 d、灌胃5 d，具体方案如图1。观察小鼠反应，若有首次滴鼻RSV造模48 h后，出现发热、寒战、蜷卧、竖毛、厌食、流涕、呼吸频率加快等为阳性反应，示造模成功。

图1 实验造模及给药方案流程图

2.3 肺组织的采集 用乙醚将小鼠麻醉后开胸取肺组织，置于－70℃保存，分别取5只肺组织用于realtime PCR检测TLR7 mRNA水平，5只肺组织用于 Western Blot检测TLR7蛋白表达水平。

2.4 Realtime PCR检测肺组织中TLR7 mRNA水平 液氮中加RNAiso plus 1 mL研磨肺组织，按说明书提取组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳及生物分光光度计对RNA定性及定量分析，按照RT-PCR试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，SYBR Green realtime PCR法检测TLR7 mRNA转录水平，TLR7引物设计参照文献 ［11］，TLR7:正义链5'-CTGGAGTTCAGAGGCAACCATT-3'，反义链 5'-GTTATCACCGGCTCTCCATAGAA-3';内参β-actin:正义链5'-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3'，反义链 5'-GTCTTTACGGATGTCAACG-3'。Real time PCR反应条件:95℃预变性10 s，95℃变性5 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45个循环，同时做熔解曲线。重复3次。Real-Time PCR结果采用相对定量法计算，2－ΔΔCt方法是Real-Time PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法［12］，ΔΔCt=(Ct样本 －Ct内参)受试组－ (Ct样本－Ct内参)对照组。

2.5 Western Blot法检测肺组织TLR7蛋白表达 液氮中研磨肺组织，每100 mg肺组织中加入500 μL增强型RIPA与PMSF混合液 (两者比例100∶1)裂解，4℃下13 000 r/min离心30 min，取上清，即为所提取之小鼠肺组织总蛋白。BCA法蛋白定量并根据结果调整使各样品总蛋白含量一致，5倍上样缓冲液蛋白变性，5%浓缩胶及10%分离胶SDSPAGE凝胶电泳，PVDF膜转印，5%TBST脱脂奶粉封闭2 h，1∶500兔源性TLR7一抗4℃孵育过夜、1∶500羊抗兔二抗孵育2 h，ECL法显色，胶片压片。ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参照蛋白进行校准，采用目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值来表示TLR7蛋白相对表达水平。

2.6 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件，单因素方差分析 (One-Way ANOVA)对结果进行统计分析，数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RSV感染BALB/c小鼠模型复制 依2.2项造模方法予RSV滴鼻48 h后，BALB/c小鼠出现精神萎糜、体温升高 (测肛温)、寒战、活动减少、蜷卧、竖毛、流涕、呼吸频率加快、厌食等阳性反应，每一组BALB/c小鼠呈现扎堆现象，示造模成功。

3.2 金欣口服液对肺组织中TLR7 mRNA的表达水平的影响 Realtime PCR检测肺组织中TLR7 mRNA水平，结果如表1所示。72 h组RSV模型组TLR7 mRNA水平为正常组的2.17倍，＞2倍示结果有意义。金欣高剂量组、等效剂量组TLR7 mRNA水平与RSV模型组比较有显著差别 (P＜0.01、P＜0.05)。144 h组RSV模型组TLR7 mRNA水平为正常组的1.13倍，无意义。各组间TLR7 mRNA表达比较无显著差别。表明感染早期 (72 h)TLR7 mRNA的表达增加;当不再感染RSV，并随着治疗的深入，144 h组TLR7 mRNA的表达渐恢复至正常水平。

3.3 金欣口服液对肺组织中TLR7蛋白表达水平的影响Western Blot法检测肺组织TLR7蛋白表达水平，显影结果如图2所示。用Image J软件分析TLR7蛋白、内参β-actin条带灰度值。用 (TLR7/β-actin灰度值比) /(TLR7/β-actin灰度值比)正常组表示TLR7蛋白的相对表达水平，并进行组间比较，结果如表2所示。72 h组中RSV模型组的TLR7蛋白表达高于正常组 (P＜0.01);与RSV模型组相比，金欣高剂量组、等效剂量组明显降低TLR7蛋白表达(P＜0.01、P＜0.05)，两者之间同样存在着量-效关系。144 h组中实验各组TLR7蛋白表达均低于正常组 (P＜0.01)，金欣组TLR7蛋白表达高于RSV模型组，但相比无差异性。表明感染早期 (72 h)，TLR7蛋白表达增加，到了144 h TLR7蛋白表达下降，金欣口服液使之趋向正常水平。

表1 RSV感染BALB/c小鼠肺组织中TLR7 mRNA表达水平(±s，n=5)

表1 RSV感染BALB/c小鼠肺组织中TLR7 mRNA表达水平(±s，n=5)

注:与 RSV模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

2 － ΔΔCt 72 h组 144 h组RSV模型组2.17 ±0.22 1.13 ±0.23利巴韦林组 1.40 ±0.16＊＊ 0.93 ±0.06金欣高剂量组 1.18±0.09＊＊ 0.88±0.29金欣等效剂量组 1.81 ±0.26* 1.07 ±0.14 F 23.244 4.357 P 0.000 0.027

图2 RSV感染BALB/c小鼠肺组织TLR7蛋白表达显影图

表2 RSV感染BALB/c小鼠肺组织中TLR7蛋白相对表达水平 (¯x ± s，n=5)

4 讨论

TLR7是Toll-like受体家族中与RSV关系最为密切的成员之一［10］，参与对细菌、病毒、寄生虫和真菌感染的免疫应答。当RSV入侵机体时，TLR7可识别RSV ssRNA，从而激活髓样分化因子MyD88依赖的信号通路，通过调节通路下游因子—干扰素调节因子7(IRF7)引起IFN-α的表达［13］。IFN-α在病毒感染早期可抑制病毒的复制，是自然免疫重要的组成部分。Lund等用泡状口腔炎病毒 (VSV)全身感染野生型和TLR7－/－小鼠，结果野生型小鼠血清中IFN-α水平明显升高，而TLR7－/－小鼠血清中只有低水平的IFN-α［14］;Xu等发现慢性乙肝患者浆细胞样树突状细胞(pDCs)受损后引起 TLR7下调，从而导致 IFN-α水平下降［15］。

金欣口服液是汪受传教授治疗小儿病毒性肺炎的临床验方，具有拮抗RSV作用。本实验通过设计72 h、144 h两个实验大组，每个实验大组又设计正常组、RSV感染模型组、利巴韦林组、金欣高剂量组、金欣等效剂量组5个实验小组，来观察金欣口服液对TLR7 mRNA及TLR7蛋白表达的影响及其随药物作用时间延长的变化趋势。结果表明，金欣口服液能下调RSV感染早期TLR7 mRNA及TLR7蛋白的表达，从而在病程早期即提高机体的抗病毒效应。而随着RSV感染的停止和治疗的持续，TLR7 mRNA及TLR7蛋白的表达下调，金欣口服液使之逐渐趋向正常水平，表明机体趋向恢复。

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