双波长薄层扫描法定量测定二至丸中齐墩果酸与熊果酸

胡俊明， 蒋晓煌， 蒋孟良*

(1．湖南省平江县大坪乡卫生院，湖南平江414509;2．湖南中医药大学，湖南长沙410208)

二至丸始载明代《医便》，由女贞子和墨旱莲等量配伍组成。具有补益肝肾，滋阴止血。用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，咽干鼻燥，腰膝酸痛，月经量多［1］。现代研究表明二至丸具有保肝降酶、滋阴、抗骨质疏松等多种生物活性［2-6］。《中国药典》2005年版与2010年版一部所载二至丸均是用双波长扫描法测定其中齐墩果酸量，因女贞子中既含有齐墩果酸，又含有熊果酸，二者为同分异构体［7］，在此条件下不能将其二者分离进行薄层定量。故《中国药典》方法实际上测得的是齐墩果酸与熊果酸二者含有量之和。经采用严氏方法［8］，将点样后的薄层板预处理，再展开测定，其测得结果准确，简单快捷，可更好、更准确地控制二至丸的内在质量标准。

1 实验材料

1.1 仪器 日本岛津CS—930型双波长薄层扫描分析仪;AB135S型电子分析天平 (分度值0.000 01 g)(梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司);DK—S22型电热恒温水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司);WGL—65(B)型电热鼓风干燥箱 (天津市泰斯特仪器有限公司);10μL微量进样器 (平头，上海安亭微量进样器厂)。

1.2 试剂 齐墩果酸与熊果酸对照品，中国药品生物制品检定所 (批号分别为110709-200905、110742-200810);硅胶G薄层板 (10 cm×20 cm):德国默克集团 (Merck KGaA);环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、冰乙酸、碘、硫酸、乙醇等均为分析纯。

1.3 药品 二至丸［1］由江西仁丰药业有限公司提供，批号:20101203、20110902、20110903。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃恒定质量的齐墩果酸与熊果酸对照品25.50 mg与12.25 mg，分别置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含齐墩果酸1.02 mg/mL、含熊果酸0.49 mg/mL的两种溶液，备用。

2.2 供试品溶液的制备 取本品研细，取约0.5 g，精密称定，置250 mL索氏提取器中，加乙酸乙酯约60 mL，加热回流提取6 h，提取液回收乙酸乙酯至干，残渣加乙酸乙酯使溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 空白溶液的制备 取除去女贞子的二至丸研细，取约0.5 g，精密称定，同供试品溶液的制备方法制备，得空白对照溶液。

2.4 预处理、层析及测定 精密吸取供试品溶液2μL、对照品溶液1μL与4μL(叠加点样，先点一种，点完后再点另一种)，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，将薄层板点样的一端浸入1%碘-二氯甲烷溶液中约12～15 mm，使溶液没过斑点迅速取出，立即覆以一玻璃板，30 min后取下玻璃板，热风吹2～3 min，挥去薄层板上残留的溶液。以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰乙酸 (20∶5∶8∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用透明胶固定，照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层扫描法)进行扫描，波长λs=530 nm，λR=700 nm，测量供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，外标两点法计算，即得。

2.5 线性关系的考察 精密吸取上述齐墩果酸与熊果酸对照品溶液各1、2、4、6、8、10μL，分别点于薄层板上，按上述2.4项方法测定吸光度积分值，以齐墩果酸与熊果酸进样量为自变量 (X)，峰面积积分值为因变量 (Y)，进行线性回归，得回归方程 Y齐墩果酸=1 120.1X+271.29，r=0.998 5;Y熊果酸=1 085.1X+71.034，r=0.998 2。

实验表明，齐墩果酸与熊果酸在1.02～10.2μg与0.49～4.9μg范围内具良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取齐墩果酸与熊果酸对照品溶液4μL，分别点于2块薄层板上，各点6份，同上述2.4项进行测定，结果齐墩果酸与熊果酸的RSD分别为1.87%与2.09%，表明仪器精密度良好。

2.7 空白试验 (阴性干扰试验) 精密吸取供试品溶液、齐墩果酸对照品溶液、熊果酸对照品溶液与空白对照溶液各2μL，分别点于同一块薄层板上，同上述2.4项方法展开、显色，结果，空白对照无齐墩果酸和熊果酸斑点，故阴性无干扰，见图1。

图1 二至丸薄层色谱图

2.8 稳定性试验 精密吸取样品供试液2μL按上述方法于0、10、20、40、60 min测定，结果，齐墩果酸与熊果酸峰面积RSD分别为1.64%与1.72%。结果表明样品60 min内测定稳定。但文献认为显色后30 min测定较好［8］。

2.9 重复性试验 取同一批二至丸样品5份，按上述方法进行提取、展开、显色、测定，齐墩果酸与熊果酸质量分数平均值为10.30 mg/g与5.17 mg/g，RSD分别为1.53%与1.86%，结果表明此方法重复性良好。

2.10 加样回收试验 取已知含有量 (含齐墩果酸10.06 mg/g、熊果酸5.00 mg/g)的二至丸样品研细，精密称定0.25 g，精密加入1.02 mg/mL齐墩果酸与0.49 mg/mL熊果酸对照品溶液各2.5 mL，同供试品液的制备方法制备样品供试液，平行6份，按上述方法测定，计算回收率，结果见表1。

表1 齐墩果酸与熊果酸加样回收试验结果

2.11 样品测定 取二至丸3批，按照上述方法制备样品供试液，同法测定，结果见表2。

表2 二至丸样品测定结果 (n=3，±s)

表2 二至丸样品测定结果 (n=3，±s)

批号 取样量/g齐墩果酸/(mg·g－1)熊果酸/(mg·g－1)20101203 0.506 2 11.00±0.55 5.30±0.28 20110902 0.500 7 10.57±0.38 5.27±0.32 20110903 0.501 6 10.62±0.46 5.46±0.36均数 10.73 5.34 RSD/%2.19 1.91

根据上述3批样品测定结果，所测二至丸中齐墩果酸的量符合《中国药典》不得少于8.0 mg的规定。

3 讨论与小结

本测定方法基本参照《中国药典》2010年版一部二至丸项下齐墩果酸的含量测定方法，因其不能将齐墩果酸与熊果酸分离，故测定结果不准确，经改进采用严华等人的方法［8］预处理后可将二者分离，使测定结果更准确。

1%碘-二氯甲烷溶液浸泡立即取出后，应用玻璃板覆盖30 min以上;预处理后，用《中国药典》环己烷-丙酮-乙酸乙酯 (5∶2∶1)为展开剂也行，但是，严华等报道的展开剂分离效果更好，Rf值更适当。喷10% 硫酸乙醇溶液110℃烘至显色清晰后，应立即用等大的玻璃板覆盖，周围并用透明胶封严，以免斑点氧化褪色。

齐墩果酸与熊果酸的定量测定方法采用HPLC法的也很多［9-10］，但因其为末端吸收，而测定时间长、成本高、速度慢，而TLCS法解决了过这些问题，可以在同一块薄层板上同时测定多个样品，且速度快。

本品中除女贞子含齐墩果酸外，墨旱莲也有［11-12］，但该制剂墨旱莲为水提取，故墨旱莲中并没有检测到齐墩果酸。齐墩果酸为植物药中广泛存在的成分，要显示其特异性，建议《中国药典》下一版，二至丸含量测定项下改为测定女贞子苷。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010年版一部［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:412-413．

［2］王莉英．二至丸的保肝降酶作用研究［J］．海峡药学，2002，14(1):14-15．

［3］莫莉莉，李秀挺，梁颂名．二至丸滋阴作用的研究 (一)［J］．新中医，1990(11):51-53．

［4］莫莉莉，李秀挺，梁颂名．二至丸滋阴作用的研究 (二)［J］．新中医，1991(6):51-54．

［5］邢薇薇，张 宏，吴锦忠，等．二至丸对肾阴虚骨质疏松大鼠的影响［J］．福建中医药，2008，39(6):45-47．

［6］赵雪莹，李胜志，李 冀．二至丸对衰老大鼠血液流变学影响的实验研究［J］．辽宁中医杂志，2008，35(6):945-946．

［7］严 华，王宝琹，鲁 静．薄层色谱法分离齐墩果酸和熊果酸［J］．药物分析杂志，2009，29(12):2168-2170．

［8］严 华，张聿梅，林瑞超．原位预处理-薄层扫描法同时测定女贞子中齐墩果酸与熊果酸的含量［J］．药物分析杂志，2009，29(7):1107-1110．

［9］林雄浩，吴岩斌，高伟城，等．高效液相色谱法同时测定二至丸中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］．福建中医学院学报，2009，19(6):23-25．

［10］王 颖，余晓琴，龙 敏．HPLC同时测定枇杷叶糖浆中熊果酸和齐墩果酸含量［J］．中成药，2009，31(9):1389-1391．

［11］吴 疆，侯文彬，张铁军．墨旱莲的化学成分研究［J］．中草药，2008，39(6):814-816．

［12］营大礼．墨旱莲的化学成分、药理作用及临床应用研究进展［J］．中国药房，2008，19(36):2876-2878．