HPLC法同时测定龙血竭片中龙血素A和白藜芦醇

程维明， 杨晓洁， 施 贝， 黄琴伟， 陈慧敏， 张文婷*

(1．浙江省食品药品检验所，浙江杭州310004;2．浙江工业大学，浙江杭州310014)

龙血竭为龙舌兰科植物剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis(Lour．)S．H．Chen的含脂木质部经提取加工制成的树脂，具有活血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮、补血益气等功效［1-4］，收载于《国家药品监督管理局药品标准》新药转正第二十二分册，在临床上用于治疗外科、妇科、内科、皮肤科等多种适应症［5］，是名贵中药材之一。龙血竭片系龙血竭药材研细后加入适量辅料直接压片而成的，收载于国家中成药标准汇编内科气血津液分册，主要含黄酮类、芪类、甾醇类和皂苷类化合物等成分［6］，其中龙血素A(loureirin A)和白藜芦醇 (resveratrol)等为主要活性成分，是其活血散瘀、生肌敛疮和补血益气等功效的物质基础，现代药理学研究也证实其均具有丰富的生物活性［7-10］。本实验采用高效液相色谱法，同时测定龙血竭片中龙血素A和白藜芦醇的量，该方法简便、准确、重复性好，可作为龙血竭片的质量控制方法研究。

1 仪器与试药

Agilent LC1200液相色谱仪 (美国安捷伦公司，配四元泵、智能柱温箱、自动进样器、VMD可变波长检测器)，电子天平 (瑞士Metter公司，AE-163)，超声波清洗器 (上海波龙公司，USC-802)，高速冷冻离心机 (美国艾本德公司，Centriguge)，所用仪器和量具均经校正和检定。

龙血素A和白藜芦醇对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为111660-200402、111535-200502;龙血竭片购自云南大唐汉方制药有限公司，批号为20120305;乙腈为色谱纯;水为超纯水;其余试剂为分析纯。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的龙血素A和白藜芦醇对照品适量，置于50.0 mL量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，摇匀，制得各对照品贮备溶液。再分别精密量取1.0 mL龙血素A和白藜芦醇对照品贮备溶液置于5.0 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为21.24和23.24μg/mL的对照品混合溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取龙血竭片20片，精密称定，研细，过4号筛，精密称约0.2 g，置50 mL量瓶中，加硅藻土0.1 g，混匀，加1%冰醋酸溶液-乙腈 (1∶1)混合溶液，超声处理15 min，放冷，定容，摇匀，取适量离心，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流动相为乙腈 (A)-1%冰醋酸(B)梯度洗脱 (0～55 min，20% ～45%A)，体积流量1.0 mL/min;检测波长260 nm;进样量10 μL;柱温35℃。在上述色谱条件下，龙血素A和白藜芦醇的保留时间分别是50.7 min和14.8 min。见图1。

2.4 线性关系考察

图1 对照品 (A)和供试品 (B)色谱图Fig.1 HPLC chromatographs of reference substances(A)and sam p le(B)

取2.1项下制备的混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件分别进样 1、2、5、10、15、20、30 μL测定，测定峰面积，将不同峰面积对各对照品进样量做线性回归，得回归方程，龙血素A为y=2 400.5x+17.44(r2=0.999 1);白藜芦醇为y=873.75x+6.45(r2=0.999 8)。结果表明，龙血素A和白藜芦醇分别在0.02～0.64μg和0.02～0.70μg内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取2.1项下制备的混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件，连续进样6次，记录龙血素A和白藜芦醇的峰面积积分值，并计算它们的RSD值，分别为0.3%、0.3%，结果表明方法的精密度良好，符合方法学要求。

2.6 重复性试验

取同一份批号的龙血竭片6份，按2.2项下的方法制备供试品溶液，于2.3项色谱条件下测定，结果表明龙血素A的RSD为0.5%，白藜芦醇的RSD为0.6%，说明表明该方法的精密度良好，符合方法学要求。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h在2.3项色谱条件下进样测定，记录各对照品峰面积，结果表明龙血素A的RSD为1.8%，白藜芦醇的RSD为1.4%，说明供试品溶液在48 h内较稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知龙血素A和白藜芦醇量的供试品6份，分别精密加入龙血素A和白藜芦醇的对照品适量，按2.2项制备供试品溶液后测定，结果见表1。

表1 加样回收率试验(n=6)Tab.1 Results of average revovery tests(n=6)

2.9 样品测定

各批号龙血竭片分别取3份，研细后，精密称取适量龙血竭粉末，按2.1项下方法制备供试品溶液，并在2.3项色谱条件下测定峰面积，结果见表2。

表2 样品测定结果Tab.2 Content determination of loureirin A and resveratrol in Longxuejie Tablets

3 讨论

实验中比较了不同柱温 (20℃、35℃、40℃)对这3种组分的分离效果的影响，结果表明，随着柱温的升高，各组分保留时间缩短，分离度基本保持一致，但为了保护柱子，延长使用寿命，最终确定柱温为35℃。

考察了回流提取和超声提取两种方法制备供试品溶液，实验结果无明显差异，但由于超声提取法具有效率高，操作简便等优点，所以采用超声提取法。在提取溶剂的选择上，分别考察了甲醇和1%冰醋酸溶液－乙腈 (1∶1)混合溶液提取，发现在相同条件下用后者提取所得的峰面积稍大，说明该溶剂提取效率稍好，故选用。同时，在用1%冰醋酸溶液－乙腈 (1∶1)混合溶液提取时，对不同超声时间 (10、15、25、30 min)进行了比较，结合指标成分的量，最终确定用1%冰醋酸溶液－乙腈 (1∶1)混合溶液在室温下超声提取15 min作为样品的处理方法。

考虑到不同色谱柱吸附性能等的差异，在耐受性试验中比较了Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)、Kromasil 100-5C18(250 mm ×4.6 mm)和 Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)3种色谱柱的分离效果，根据图谱的分离效果，选择了 Agilent Zorbax SB-C18进行深入的方法学考察研究。

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