多花野牡丹精制提取物中有机酸定性分析及柠檬酸定量测定

王起运， 曾佳烽， 方 通， 潘俊芳， 张朝晖*

(1.江苏大学药学院，江苏镇江 212013;2.上海华拓医药科技发展股份有限公司，上海 201201)

多花野牡丹Melastoma affineD.Don为野牡丹科野牡丹属植物，主要分布在我国的西南或南部地区［1-2］。临床研究表明多花野牡丹水煮浓缩得到的浸膏对轻度、中度和重度宫颈糜烂都有很好的疗效，300例患者中治愈率为99.33%，有效率为100%［3-4］。多花野牡丹水提取物，经精制、纯化得到的有效部位，是妇科赛菲凝胶的主要成分。该精制提取物水溶液的pH为2～3，预实验显示，其中含有多种有机酸。赛菲凝胶在阴道中形成的弱酸性环境可以抑制有害病菌的生长，有利于消除感染，有机酸是其主要的有效成分之一。对多花野牡丹精制提取物用RP-C18柱进行了HPLC分析，没食子酸可以得到较好的分离，经测定含有量为2.7%，但其他有机酸亲水性强，用RP-C18柱难以进行有效的定性和定量分析。

离子色谱法是20世纪70年代中期诞生的一项分析测试技术，能同时分离测定多种有机酸和无机阴离子，操作简单，灵敏度高，在环境、食品、生物医学、制药、日化等领域已广泛应用［5-11］。目前，还没有人用离子色谱方法对多花野牡丹中有机酸进行系统的分析。本实验用Ion Pac AS11-HC色谱柱对多花野牡丹精制提取物中亲水性有机酸进行了分离，并对其中含有量较高的柠檬酸进行了定量测定。

1 仪器及试药

Dionex ICS-2100型离子色谱仪 (戴安，美国)，配EGCⅡ KOH淋洗液自动发生器，Thermo IonPac AS11-HC(4 mm×250 mm)分离柱，Thermo Dionex IonPac TM AG11-HC(4 mm×50 mm)保护柱;Chromeleon 6.80色谱工作站，电化学发生抑制器，恒温电导检测器。

乙酸钠、乳酸、甲酸、丙酮酸、L(+)酒石酸、DL-苹果酸、草酸、富马酸、柠檬酸、NaF、无水 Na2SO4、NaNO2、KNO3、Na3PO4·12H2O、KCl购自国药集团化学试剂有限公司，柠檬酸对照品 (批号:111679-200401)购自中国药品生物制品检定所。

2 溶液制备

2.1 混合对照品贮备液 分别取适量分析纯试剂乙酸钠、乳酸、甲酸、丙酮酸、L(+)酒石酸、DL-苹果酸、草酸、富马酸、柠檬酸、NaF、NaNO2、无水 Na2SO4、KCl、KNO3、Na3PO4·12H2O 用水溶解，制成1 mg/mL的贮备液，一周内使用。临用时分别精密移取上述贮备液至量瓶中，用水定容，得到柠檬酸20 μg/mL、F－为3 μg/mL、Cl－为4 μg/mL、其他对照品为10 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液 多花野牡丹叶片经水提、80%乙醇醇沉，醇沉上清液减压浓缩后上D101大孔树脂柱，水洗液减压浓缩即得精制提取液 (该提取液由海南华拓天涯制药有限公司提供，批号20111201，每克含3.57 g生药)，减压浓缩至干。精密称取上述干燥物76.30 mg于10 mL量瓶中，去离子水溶解定容;用移液管精密量取1 mL至5 mL量瓶中，去离子水定容，得1.53 mg/mL样品溶液。经PT-系列固相萃取柱和0.45 μm滤膜过滤，滤液作为供试品溶液1。多花野牡丹精制提取液 (批号20120301，20120302)为自行按照工艺制备，同上法处理，得供试品溶液2和供试品溶液3。

3 多花野牡丹中有机酸定性

3.1 离子色谱条件 ICS2100型离子色谱仪:35℃;进样量25 μL;由EGCⅡ KOH淋洗液自动发生器生成1～40 mm/L KOH梯度淋洗液;体积流量1.0 mL/min;抑制电流为75 mA;电导检测器检测。

3.2 淋洗液浓度的选择 有机酸和无机阴离子的色谱保留性质存在较大差异，弱保留的一元酸如乳酸、乙酸、甲酸、丙酮酸等，中等保留的二元酸如苹果酸、酒石酸、草酸、富马酸等，强保留酸如柠檬酸等，对于强弱保留不同的离子，只能采用梯度淋洗，等度淋洗会出现多种组分共同淋洗下来的现象，在分析有机酸的时候，还要避免无机离子的干扰。

IonPac AS11-HC型阴离子分离树脂柱的填料是亲水的微孔薄壳型阴离子交换树脂，基核是乙基乙烯基苯的聚合物，离子交换功能基是季铵基-N+(ROH)3，亲水性较强［6，12］。本实验采用 EGCⅡKOH淋洗液自动发生器在线生成高纯度的KOH淋洗液，可以避免杂质污染，保证淋洗液浓度的准确，最大限度降低淋洗时的基线漂移和淋洗液浓度在线变化，平衡时间短，可方便实现梯度淋洗。梯度淋洗程序见表1。

表1 有机酸及无机阴离子的KOH溶液梯度淋洗程序Tab.1 KOH gradient elution program of organic acids and inorganic anions

3.3 色谱分离情况 图1为有机酸、无机阴离子混合对照溶液色谱图，图2为多花野牡丹精制提取物的色谱图。从图1可知，在考察的有机酸种类中，草酸和富马酸部分重叠，其余组分均达到完全分离，且 常见的 Cl－、NO－、NO－、SO2－、234PO43－等无机阴离子与所测定的有机酸的保留时间不同。与对照溶液的图谱对比，多花野牡丹精制提取物色谱图中，在乳酸和乙酸出峰的位置可能因糖类的多羟基成分的干扰，致使F－、乳酸和乙酸未能达到基线分离。

4 多花野牡丹提取物中柠檬酸定量测定

4.1 离子色谱条件 ICS2100型离子色谱仪;35℃;进样量25 μL;由EGCⅡ KOH淋洗液自动发生器生成35 mm/L KOH梯度淋洗液;体积流量1.2 mL/min;抑制电流为104 mA;电导检测器检测。

图1 混合对照溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed control ions

图2 样品色谱图Fig.2 Chromatogram of samples

4.2 方法与结果

4.2.1 标准曲线的测定 取柠檬酸对照品 (批号:111679-200401)适量，精密称定，加去离子水制成每1 mL含100 μg的对照品溶液，精密移取上述溶液稀释成含 5、10、20、30、40、50、60 μg/mL的柠檬酸对照品溶液，在上述实验条件下测定其线性范围，并绘制峰面积Y(μs)对质量浓度X(μg/mL)的标准曲线。计算得回归方程为Y=0.061 4X+0.110 1(r=0.999 9)，线性范围为5 ～60 μg/mL。

4.2.2 加样回收率试验 精密称取样品9份 (批号:20111201)，分成低、中、高3组，每组3份，分别精密添加柠檬酸对照品 20 μg、25 μg、30 μg，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算回收率和RSD。结果总平均加样回收率 (n=9)为100.27%，RSD为1.28%。表明本法具有良好的回收率。

4.2.3 精密度试验 配制20 μg/mL的柠檬酸对照品溶液，连续进样6次，测得柠檬酸峰面积的RSD(n=6)为0.49%。表明仪器精密度良好。

4.2.4 重复性试验 取同一批次 (批号:20111201)样品6份，按2.2项下方法平行制备成6份供试品溶液，进样分析，测得柠檬酸的RSD(n=6)为0.87%。表明本法重复性良好。

4.2.5 样品中柠檬酸测定 取不同批次提取的多花野牡丹样品进行柠檬酸定量测定，每一批样品按2.2项下方法制备3份供试品溶液，进样分析，结果见表2。

表2 样品中柠檬酸测定结果 (n=3)Tab.2 Contents of citric acid in the samples

5 结论

用离子色谱法对多花野牡丹精制提取物中有机酸的分析结果表明，多花野牡丹精制提取物中含有乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、草酸、柠檬酸等亲水性有机酸以及F－、Cl－、NO3－、SO4

2－等无机阴离子。其中柠檬酸的量大于3%，其余有机酸的量均低于1%。离子色谱法操作简便、快速、分离度好、灵敏度高，可用于多花野牡丹精制提取物中亲水性有机酸的定性定量分析。

通常，由于样品中较大极性成分的干扰，RPC18柱HPLC法对极性强的有机酸进行分析时存在一定的困难，而离子色谱法，能够不受这些物质的干扰，对有机酸的分析有着独特的优势。

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