HPLC法测定镇痛口服液中2种生物碱类成分

张 浩， 张 庆

(湖北省食品药品监督检验研究院，湖北武汉 430064)

镇痛口服液处方由洋金花、制草乌、闹羊花、细辛、姜黄五味药组成，具有活血通络、散寒止痛的功效，用于血栓闭塞性脉管炎、肝癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤属寒凝淤滞所致的疼痛。原质量标准为国家药监局注册标准WS3-734(Z-138)-2005(Z)，用TLC-SCAN法测定东莨菪碱的量，方法精密度、准确度均较差，无法很好控制产品质量。本实验采用HPLC法测定洋金花中主要生物碱类成分的量，方法准确，可控性更强。

1 仪器与试药

Waters e2695-2489高效液相色谱仪、DIONEX U3000高效液相色谱仪、DIONEX P680高效液相色谱仪;Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)色谱柱;AG135型电子天平;MS204S/Z型电子天平。氢溴酸东莨菪碱 (批号100049-200308供定量测定用)、硫酸阿托品 (批号100040-200510供定量测定用)，购于中国药品生物制品检定所;乙腈、庚烷磺酸钠为色谱纯;甲醇、乙酸钠、冰醋酸为分析纯;水为重蒸水。镇痛口服液由李时珍医药集团有限公司提供，批号:201109001、201109002、201109003。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 参考《中国药典》2010年版一部洋金花药材含量测定项下色谱条件［1］，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择相应离子对试剂，进行试验，结果以乙腈－0.05 mol/L乙酸钠 (含0.012 5 mol/L庚烷磺酸钠，用冰醋酸调pH至6.0)(20∶80)为最佳流动相。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 针对生物碱类成分进行提取纯化。精密量取本品50 mL，置分液漏斗中，加稀盐酸调pH值至1～2，摇匀，加三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，弃去三氯甲烷层，分取酸水层，加氨试液调节pH值9～10，摇匀，加三氯甲烷提取5次，每次30 mL，合并三氯甲烷层，挥干，残渣加流动相使溶解，转移至5 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取两种对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含氢溴酸东莨菪碱0.35 mg(折算成东莨菪碱为0.24 mg)、硫酸阿托品90 μg的溶液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取处方中缺洋金花的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别依法测定，同时测定相应时间的DAD光谱图，在该色谱条件下，在与氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品保留时间相同的位置不出现色谱峰，表明其他成分对两者测定无干扰，见图1。

图1 混合对照品溶液 (A)供试品溶液 (B)与阴性对照溶液 (C)色谱图Fig.1 HPLC chromotographs of reference substance(A)，sample(B)and solution without scopolamine hydrobromide and atropine sulfate(C)

2.3.2 线性关系考察 取混合对照品溶液，氢溴酸东莨菪碱为0.498 6 mg/mL、硫酸阿托品为0.096 8 mg/mL，分别进样 1、2、5、10、20 μL，以测得峰面积Y对进样量X(μg)进行线性回归。结果表明，氢溴酸东莨菪碱的进样量在0.498 6～9.297 2μg范围内，线性关系良好，Y=16 122.6+678 293.7X(r=0.999 9);硫酸阿托品的进样量在0.096 8～1.936 0 μg范围内，线性关系良好，Y=33 533.4+826 748.0X(r=0.999 7)。

2.3.3 精密度试验 精密吸取二者混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下重复进样6次，以氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品的峰面积计算RSD(n=6)，分别为0.75%、0.89%。结果表明，仪器精密度符合要求。

2.3.4 重复性试验 分别精密称取同一批号样品(批号201109001)适量，共6份，照2.2.1项方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，东莨菪碱质量浓度为20.29 μg/mL，RSD(n=6)为2.36%、硫酸阿托品质量浓度为6.91 μg/mL，RSD(n=6)为2.23%。结果表明，该方法重复性良好。

2.3.5 回收率试验 采用加样回收率法。分别精密量取已知含有量的样品25 mL(批号201109001，东莨菪碱质量浓度为20.29 μg/mL、硫酸阿托品质量浓度为6.91 μg/mL)，共6份，精密加入氢溴酸东莨菪碱对照品1 mL(0.464 4 mg/mL，折算成东莨菪碱为0.321 4 mg/mL)及硫酸阿托品对照品1 mL(0.242 4 mg/mL)，按2.2.1项操作，测定并计算供试品中东莨菪碱、硫酸阿托品的回收率，结果见表1，可见本法回收率较好。

表1 氢溴酸东莨菪碱与硫酸阿托品回收率试验结果Tab.1 Results of recoveries for scopolamine hydrobromide and atropine sulfate

2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液 (批号201109001)分别于0、2、4、6、8、10 h内进行分析，进样量10 μL，氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品峰面积的RSD(n=6)分别为1.77%、1.92%。结果表明供试品溶液在10 h内稳定良好，可满足检测时间的需要。

2.3.7 不同色谱柱耐用性 精密称取同一批号(批号201109001)的样品，按2.2.1项方法制备供试品溶液，采用DIONEX Acclaim 120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、依利特 Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱在上述色谱条件下进行分析。以氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品的峰面积计算RSD(n=6)，分别为0.38%、0.56%。结果表明，3种色谱柱测定结果精密度良好。

2.4 样品测定

用HPLC法测定两种生物碱，并与原标准采用TLC-SCAN法测定氢溴酸东莨菪碱进行比较。结果见表2。

表2 样品测定结果 (μg·mL－1)Tab.2 Results of determination by HPLC and TLC scan(μg·mL－1)

3 讨论

，氢溴酸东莨菪碱的HPLC流动相，有甲醇-水［2-3］(40∶60，水中含0.02 mol/L 醋酸钠、0.02%三乙胺、用冰醋酸调pH至6.0)、甲醇-水［4］(含 0.025 mol/L庚烷磺酸钠及 0.05 mol/L醋酸钠，以醋酸调pH=4.6)(45∶55)、甲醇-水［5］(53 ∶47，水中含 20 mmol/L 醋酸钠，0.02%三乙胺，0.3%四氢呋喃，pH为6.86)等，多所选缓冲盐［6］或离子对系统［7-10］，且对pH均有控制。尚有采用GC法进行测定［11］。本实验所用流动相系统，所用醋酸盐及庚烷磺酸钠，比《中国药典》2010年版洋金花测定项下磷酸盐及十二烷基硫酸钠，更有利于保护色谱柱，并通过实验确定最佳离子对试剂浓度与适宜pH值。

原标准TLC-SCAN法仅测定氢溴酸东莨菪碱，结果与HPLC法相比相差近30%，且TLC-SCAN法操作过程误差较大，斑点显色后不稳定，易褪色，测定波长选择不合适，故无法控制该产品质量。HPLC法可同时测定该制剂中两种生物碱类成分的量，方法灵敏准确，可控制性强，完全可替代TLC-SCAN法用于控制该产品质量。

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