正交试验法比较女贞子中齐墩果酸与特女贞苷的乙醇提取工艺

郭宇洁， 任 烨， 葛争艳， 孟 硕， 金 龙， 李雪丽， 刘建勋

(中国中医科学院西苑医院实验中心，北京 100091)

女贞子系木犀科植物女贞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾和明目乌发的功效［1］。主要成分有三萜类、环烯醚萜类、苯乙醇类和黄酮类等成分［2-5］。女贞子系降糖消脂片的君药，针对女贞子的乙醇提取工艺进行了重点研究。2005版《中国药典》女贞子以齐墩果酸为质量控制指标［6］，2010版《中国药典》女贞子以特女贞苷为质量控制指标［1］。为更好地提取出女贞子的有效成分，本实验既以齐墩果酸为指标成分，又以特女贞苷为指标成分，以正交试验法进行女贞子的乙醇提取工艺研究，所筛选的提取工艺兼顾了两种成分的提取，并对比两版药典不同质量控制标准对女贞子醇提工艺的影响。

1 仪器与试剂

AglientHP1100高效液相色谱仪 (美国);BRANSON超声清洗器 (上海必能信超声有限公司);METTLER AE240电子天平 (梅特勒－托利多仪器有限公司)。

齐墩果酸标准品 (中国药品生物制品检定所，批号:110709-200304);特女贞苷对照品 (中国中医科学院中药研究所，编号为090528);女贞子药材［河北神农 (北京)药业有限公司，批号050428］;乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 齐墩果酸的测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含齐墩果酸0.20 mg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取女贞子提取物0.4 g，精密称定，加入甲醇20 mL，加热回流45 min，放冷，转移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器和残渣，洗液转移至同一量瓶中，摇匀，用微孔滤膜 (0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 齐墩果酸色谱条件［7-11］岛津 Shim-pack CLC-ODS色谱柱 (6.0 mm×150 mm，5 μm);甲醇－0.05%磷酸水 (90∶10)为流动相;柱温为2℃;检测波长为215 nm。理论塔板数按齐墩果酸计算应不低于3 000。对照品进样量、供试品进样量均 15 μL。

2.1.4 齐墩果酸线性关系考察 精密称取齐墩果酸4.95 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，配制成每1 mL甲醇含0.495 mg的齐墩果酸标准品溶液，进样体积分别为2、4、6、8、10、16、18 μL，注入高效液相仪，测定峰面积，以齐墩果酸的进样量 (μg)为横坐标 (X)、峰面积为纵坐标 (Y)作图，进行线性回归，回归方程为Y=797.432 382 4x+5.787 446 678，r=1.000 0(n=7)。说明齐墩果酸在0.99～8.91 μg之间线性关系良好。

2.1.5 齐墩果酸精密度试验 将供试品溶液注入高效液相仪，重复进样5次，测定峰面积，计算齐墩果酸的RSD为1.21%，说明仪器的精密度良好。

2.1.6 齐墩果酸回收率试验 精密称取已知齐墩果酸质量浓度的样品适量共6份，置20 mL量瓶中，分别精密加入相当于已知对照品量的50%、100%的齐墩果酸对照品，甲醇溶解定容，其余按供试品溶液制备方法进行测定，齐墩果酸的平均回收率为99.71%，RSD为1.05%。

2.2 特女贞苷的测定

2.2.1 特女贞苷对照品溶液制备 精密称取特女贞苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含特女贞苷0.10 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取女贞子提取物0.15 g，精密称定，加入甲醇20 mL，加热回流45 min，放冷，转移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器和残渣，洗液转移至同一量瓶中，摇匀，用微孔滤膜 (0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 特女贞苷色谱条件［12-16］Waters Symmetry C18色谱柱 (3.9 mm×150 mm，5 μm);乙腈－水(17∶83)为流动相;检测波长为224 nm。柱温为室温。理论塔板数按特女贞苷计算应不低于4 000。对照品进样量、供试品进样量均15 μL。

2.2.4 特女贞苷线性关系 精密称取特女贞苷标准品适量，加入甲醇制成每1 mL甲醇含0.089 6 mg的特女贞苷标准品溶液，进样体积分别为5、10、15、20、25、30、35 μL，注入高效液相仪，测定峰面积，以特女贞苷的进样量 (μg)为横坐标 (X)、峰面积为纵坐标 (Y)作图，进行线性回归，回归方程为Y=1 326 951.834 17x+16 219.677 936，r=0.999 9(n=8)。特女贞苷在0.179 2～3.316 μg范围内呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 将供试品溶液，注入高效液相仪，重复进样5次，测定峰面积，特女贞苷的RSD为0.35%，仪器精密度良好。

2.2.6 回收率试验 精密称取已知特女贞苷质量浓度的样品适量，置25 mL量瓶中，分别精密加入相当于已知对照品量的100%的特女贞苷标准品溶液，加入甲醇溶解定容，其余按供试品溶液制备方法进行测定，特女贞苷平均回收率为103.29%，RSD为1.25%。

2.3 女贞子乙醇提取工艺

2.3.1 以齐墩果酸为指标的醇提工艺 准确称取破碎过的女贞子药材20 g，共9份，选定醇提浓度、醇提倍数和醇提次数三个因素作为正交试验的考察因素，每个因素各取三个水平，提取时间为2 h。采用L9(34)正交表进行正交试验。因素水平表见表1。样品减压干燥后进行以HPLC法测定齐墩果酸，其正交结果见表2，对表2的结果进行统计学处理后，其方差分析见表3。

表1 因素水平 (2005年版《中国药典》齐墩果酸)Tab.1 Fators and levels(Oleanolic Acid of Chinese Pharmacopoeia 2005)

以齐墩果酸为指标进行直观分析 (见表2)和方差分析 (见表3)，影响因素顺序为A＞C＞B，即醇提浓度＞醇提次数＞加醇倍数;最佳工艺为A2B3C3，即以齐墩果酸为考察指标，最佳提取工艺为A2B3C3，即以6倍量75%乙醇提取三次，每次2 h。方差分析结果表明3个因素对齐墩果酸的提取效果均无显著性影响。

表2 正交试验结果 (2005年版《中国药典》齐墩果酸)Tab.2 Results of orthogonal test(Oleanolic Acid of Chinese Pharmacopoeia 2005)

表3 方差分析 (2005年版《中国药典》齐墩果酸)Tab.3 Variance analysis(Oleanolic Acid of Chinese Pharmacopoeia 2005)

2.3.2 以特女贞苷为指标的醇提工艺 准确称取破碎过的女贞子药材20 g，共9份，选定醇提浓度、醇提倍数和醇提次数三个因素作为正交试验的考察因素，每个因素各取三个水平，提取时间为2 h。采用L9(34)正交表进行正交试验。因素水平表见表4。样品减压干燥后进行以HPLC法测定特女贞苷，其正交结果见表5，对表5的结果进行统计学处理后，其方差分析见表6。

表4 因素水平 (2005年版《中国药典》特女贞苷)Tab.4 Fators and levels(Specnuezhenide of Chinese Pharmacopoeia 2010)

以特女贞苷为指标进行直观分析 (见表4)和方差分析 (见表5)，影响因素顺序为C＞B＞A，即醇提次数＞加醇倍数＞醇提浓度;方差分析结果表明C因素对特女贞苷的提取效果有显著性影响。即:以特女贞苷为考察指标，最佳提取工艺为A3B3C3，即以6倍量75%乙醇提取3次，每次2 h。

2.3.3 女贞子提取工艺验证试验 准确称取破碎过的女贞子药材20 g共3份，按最佳提取工艺条件提取，进行验证试验，结果见表7。

表5 正交试验结果 (2010版《中国药典》特女贞苷)Tab.5 Results of orthogonal test(Specnuezhenide of Chinese Pharmacopoeia 2010)

表6 方差分析 (2010版《中国药典》特女贞苷)Tab.6 Variance analysis(Specnuezhenide of Chinese Pharmacopoeia 2010)

表7 验证试验结果Tab.7 Results of verification test

由以上实验可知，女贞子以齐墩果酸为考察指标 (2005年版《中国药典》)和以特女贞苷为考察指标 (2010年版《中国药典》)进行醇提工艺优选时，最佳工艺均为女贞子以6倍量75%乙醇提取3次，每次2 h。验证试验表明优选出的提取工艺稳定、合理、可行。此提取条件可以兼顾到女贞子中齐墩果酸和特女贞苷成分的提取，更有效保证女贞子的提取效果。

3 讨论

齐墩果酸为2005版《中国药典》中女贞子的质量控制指标，在建立齐墩果酸HPLC法测定方法的同时，也必须同时建立HPLC测定熊果酸的方法，因为齐墩果酸和熊果酸是同时存在于女贞子药材中的两个同分异构体，两者理化性质非常接近。本研究通过试验，建立了HPLC法同时测定齐墩果酸和熊果酸的方法。

齐墩果酸进行HPLC法测定时，柱温的选择很关键。曾在柱温25℃、17～18℃、5℃和2℃等条件下进行研究，发现当柱温为2℃时齐墩果酸和熊果酸的分离度大于1.5，符合要求，故选择柱温2℃，解决了HPLC法同时测定齐墩果酸和熊果酸的问题。见图1～2。

在女贞子的工艺研究中，齐墩果酸、熊果酸和特女贞苷均为女贞子的有效成分，前者优选的醇提条件和后者优选的醇提条件正好一致，相一致的提取工艺仅适用于女贞子，不同的中药需要不同对待和研究。中药材工艺考察时应该以两种成分或者多种成分的综合提取效果进行评价，必要的时候结合药理药效结学评价，才能充分保证提取工艺的可行性和药物的药效。

图1 齐墩果酸和女贞子药材的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of oleanolic acid and Ligustri Lucidi Fructus.

图2 特女贞苷对照品 (A)、女贞子药材样品 (B)液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of specnuezhenide reference substance(A)and sample of Ligrustri lucidi Fructus(B)

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