伴侣动物沙门氏菌的分离鉴定及耐药性试验

李玉兰

（青海省海北州刚察县沙柳河镇兽医站，海北 812300）

伴侣动物沙门氏菌的分离鉴定及耐药性试验

李玉兰

（青海省海北州刚察县沙柳河镇兽医站，海北 812300）

沙门氏菌是革兰氏阴性、细胞内寄生的人畜共患的肠道致病菌。迄今为止，世界已发现2 523个血清型。其中，我国发现的有216种。本菌一年四季均可引发疾病，一般呈现散发或地方流行。多种因素可促使本病的发生，如环境污染、畜舍拥挤，分娩、手术和新引进家畜未实行隔离检疫等都可能造成该病的流行。East Anglia 大学的研究表明：沙门氏菌感染的发生不仅存在商店或厨房，而且在饲养场和饲料中也是重要来源。

目前，依然采取常规分离鉴定技术分离沙门氏菌。国内外学者相继建立了诸如免疫磁性分离技术、免疫荧光标记、“四管法”检测技术、生物素标记DNA 探针、菌落杂交检测技术、核酸检测技术、SPA-协同凝集试验、PCR 检测技术及常规ELISA 法和双抗夹心ELISA法等。自1992年Rahn等首次设计出针对沙门氏菌的特异性引物用于沙门氏菌PCR检测以来，国内外的许多学者陆续进行了利用PCR技术检测沙门氏菌的研究，并研制成适合临床应用的检测试剂盒，通过对粪便、水、饲料、畜产品等样品的沙门氏菌检测，为沙门氏菌的检测又提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。这些方法虽然敏感性高和特异性好，但检测成本高，易出现假阳性，且需要的仪器昂贵，不适宜基层应用。本试验选择国标法GB 47894-2010对伴侣动物源沙门氏菌进行分离鉴定及耐药性试验，现将试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 随机无菌采取西宁市部分宠物医院（和谐、加旺、百斯特）各种犬猫鼻腔分泌物棉签及直肠深部棉签，分别剪去末端投入灭菌小试管中并编号，置4℃冰箱备用。

1.1.2 培养基及试剂 SS培养基、麦康凯培养基、营养肉汤、普通琼脂斜面、0.85%生理盐水、靛基质培养基均由青海大学农牧学院传染病实验室制备。葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、水杨苷、MR、V-P、明胶、硫化氢、西蒙氏枸橼酸盐、硝酸盐、半固体和尿素酶等生化培养基均购于北京陆桥技术有限责任公司（批号：080606）。

1.1.3 分型血清 沙门氏菌属诊断血清（卫生部兰州生物制品研究院所生产，批号810003）。

1.1.4 药敏纸片 氟啶酸（ENX）、呋喃妥因（FT）、头孢吡肟（FEP）、希刻劳（CEC）、丙氟哌酸（CF）、阿莫西林（AMX）、克林霉素（CM）、强力霉素（DX）、罗美沙星（LMF）、利福平（RA）、磺胺异噁唑（SLZ）、氟罗沙星（FO）、万古霉素（VA）、氯霉素（C）、磷霉素（FOS）、乙基西梭霉素（Netromycin）、复方新诺明（SXT）、左氧氟沙星（LVF）、美洛西林（MEZ）、奥复星（OF）、链霉素（S300）、青霉素（P）、先锋霉素VI（CH）、头孢哌酮（CFP）、卡那霉素（K）、氨卡西林（AMP）、头孢呋辛（XM）、头孢噻肟（CTX）、妥布霉素（TM）、羧苄青霉素（AMP）、头孢美唑（CMZ）、四环素（TE）、哌拉西林（PIP）、复达欣（CAZ）、丁胺卡那霉素（AN）、红霉素（E）、先锋霉素V（CFZ）、头孢曲松（CRO）、庆大霉素（GM10）、阿奇霉素（AZI）40种药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司。

1.1.5 主要试验仪器 游标卡尺（0～150 mm，上海量具刃具厂）；微量移液器（上海科华实验系统有限公司）；SHZ-82回旋式气浴恒温振荡器（金坛市科析仪器有限公司）；AB204-E，METTLER TOLEDO电子天平（瑞士产）；琴岛-得贝FF40冰箱（中国青岛冰柜厂生产）；YXQ-SG46-280手提式轧电两用高压蒸汽灭菌器（丹东市日用五金厂生产）；0704224单筒光学显微镜（中国重庆奥特光学仪器有限公司）；KMC-1300V 涡旋混合器（上海市跃进医疗器械一厂）；HH-B11-600电热恒温培养箱（天津市实验仪器厂）等。

1.1.6 试验动物 健康昆明系小白鼠18只（雌雄不分），12～16 g/只（均购于青海省地方病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 用微量移液器分别无菌吸取0.85%灭菌生理盐水各2 ml依次加入灭菌的小试管中，并相应编号，并在涡旋混合器上震荡，每支试管震荡15 min/次，连续3次。

1.2.2 样品增菌 分别用微量移液器吸取上述处理好的混悬液1 ml各加入到相应的灭菌营养肉汤中，37℃回旋式气浴恒温振荡器培养16～18 h。

1.2.3 目的菌的分离 分别无菌勾取上述肉汤培养物2～3接划线种环于SS培养基平板上，37℃温箱培养18～24后观察菌落形态。

1.2.4 目的菌的纯化 挑选SS平板上可疑菌落并进行涂片，革兰氏染色镜检，同时进行数次纯化培养，并将纯化好的疑似沙门氏菌分别划线接种于普通琼脂斜面，37℃温箱培养18～24 h后置4℃冰箱备用。

1.2.5 生化鉴定 将上述纯化好的疑似沙门氏菌菌株分别无菌接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、水杨苷、MR、V-P、明胶、硫化氢、西蒙氏枸橼酸盐、硝酸盐、半固体、尿素酶、靛基质等生化培养基中，37℃温箱培养24～48 h，观察结果。

1.2.6 血清学分型 操作方法依据163种沙门氏菌属诊断血清使用说明书进行。

1.2.7 药敏试验 随机选取将上述纯化好的2株沙门氏菌菌株分别划线接种到普通琼脂斜面上，37℃温箱培养18～24 h后，再用0.85%灭菌生理盐水无菌洗涤，并且用麦氏比浊管比浊，选取9×108活菌/ml浓度的菌悬液，用灭菌棉签蘸取菌液并在管内壁上挤去多余的菌液，均匀涂布MH（A）培养基表面（培养基厚度约为4 mm），每次涂布完1/3平板时将平板旋转60°直至涂满整个平板，连续涂布3次，保证涂均匀。再分别依次贴上上述40种药敏纸片，每块平板贴3片，37℃培养18～24 h判定结果。判定标准参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）药敏纸片扩散法法规。

1.2.8 致病性试验 随机选取上述进行药敏试验用的1株沙门氏菌菌悬液（9×108活菌/ml）腹腔注射小白鼠1只，0.5ml/只；同时用0.85%灭菌生理盐水注射小白鼠1只作对照，0.5ml/只。

2 结果

2.1 目的菌的培养特性及菌落形态观察

在SS培养基上生长呈现出圆形、隆起、边缘整齐、灰白色的菌落，大部分菌落中心变黑，边缘灰白色；在麦康凯琼脂平板上形成圆形、隆起、边缘整齐、灰白的菌落；在营养肉汤中生长较好，呈现均匀浑浊。经革兰氏染色镜检，镜下见革兰氏阴性，无芽孢的小杆菌。

2.2 生化鉴定

常规分离培养鉴定技术检出样品中沙门氏菌23株，阳性率为18.8%（23/122）。其中Q1是4#、9#、5-1、7#；Q2是8#、3-2、12#、10#、8-2；Q3是3-1、6#、2-2、1#、7-1、4-2；Q4是23-2、11#、5#、2#；Q4是3#、9-2、14-2、6-2。

表1 23株沙门氏菌的生化反应结果

2.3 血清学分型

通过血清学分型共检出鼠伤寒沙门氏菌7株，占整个分离株的30.44%（7/23）；丙型副伤寒沙门氏菌4株占整个分离率的17.40%（4/23）；基尔瓦沙门氏菌Ⅱ2株占整个分离率的8.70%（2/23）；伤寒沙门氏菌4株，占整个分离率的17.40%（4/23）；阿邦尼沙门氏菌、彻斯特沙门氏菌和鲁齐齐沙门氏菌各1株，占整个分离率的4.35%（1/23）；甲型沙门氏菌3株，占整个分离率的13.04%（3/23）。结果详见表2。

表2 沙门氏菌血清学鉴定结果

2.4 药敏试验

用游标卡尺测量抑菌圈直径的大小，测量3次，即最长值、最短值、中间值，最后求3次测量值的平均值。试验结果见表3、表4。

表3 沙门氏菌耐药性检测结果

表4 2株沙门氏菌敏感、中介、耐药数统计（单位：种）

2.5 致病性试验

试验组小白鼠于24 h内死亡，证明分离菌对小白鼠有一定的致死作用。对照组小白鼠饲喂1周后仍健活。无菌采取肝、脾等脏器触片，革兰氏染色，镜检见到与上述形态、染色一致的病原菌，并从死鼠肝、脾中分离出该病原菌，再将这2株分离菌进行生化鉴定。结果显示，从死亡小鼠体内和从样品中分离的病原菌生化结果完全一致。

3 讨论

3.1 沙门氏菌分离情况

本次分离到沙门氏菌菌株23株，阳性率为18.8%（23/122）。经血清学鉴定，23株沙门氏菌中鼠伤寒沙门氏菌占7株；甲型副伤寒沙门氏菌3株；丙型副伤寒沙门氏菌4株；阿邦尼沙门氏菌、彻斯特沙门氏菌和鲁齐齐沙门氏菌各1株；伤寒沙门氏菌4株；基尔瓦沙门氏菌Ⅵ2株。由此可见鼠伤寒沙门氏菌为其中的优势菌株，占整个分离株的30.44%（7/23）；而阿邦尼沙门氏菌、彻斯特沙门氏菌和鲁齐齐沙门氏菌各1株，占整个分离株的4.35%（1/23）。

3.2 血清型不同，致病情不同，症状不同

该菌有两种适应的宿主血清型，对不同的畜禽其致病性不一样的。主要感染的动物有猪、牛、羊、马、骆驼、兔、毛皮动物及禽等。在各种动物上能引起发病的血清型不同，共同症状是食欲下降、下痢，有的还能造成流产等 。

3.3 人兽共患

近几年来，医院内婴幼儿和动物感染沙门氏菌都十分严重，并有逐步成上升的趋势，沙门氏菌一旦感染人就会造成人的胃肠炎急病和食物中毒。临床表现主要是恶心、呕吐、腹泻、头晕、发烧、四肢无力等症状。人感染沙门氏菌主要是与食用了被沙门氏菌污染的食物有关。

3.4 抗生素治疗

耐药性问题已成为全世界关注的焦点，由于滥用抗生素，沙门氏菌的抗菌谱越来越广，强度也越来越大。为此，我们从分离的23株沙门氏菌中随机选取了2株沙门氏菌分离株进行了耐药性监测。结果显示，4#菌株对于VA、FT、SXT、E、TE、CM、P、AZI、S300和FO等15种药物有耐药性，耐药率37.5%（15/40）；23-2#菌株对于FT、VA、E、TE、C、S300、FO和AZI等13种药物有耐药性，耐药率为32.5%（13/40）。

3.5 预防

由于伴侣动物与人接触密切，尤其是少年儿童对于伴侣动物尤为偏爱。所以对于经常接触宠物且没防范措施的儿童来说，极易感染沙门氏菌。在本次药敏监测中，4#菌株对TM、PIP、AMP、FEP、LVF、FOS、MEZ、XM、CFZ、ENX和AMP等20种药物敏感，敏感率50.00%（20/40）；对CAZ、Netromycin、CEC、AMX和CF等5种药物中介，中介率12.5%（5/40）。23-2#菌株对SXT、PIP、AMP、FEP、CAZ、CAZ、CRO、MEZ、SLZ、XM、CFZ和AMP等20种药物敏感，敏感率50.00%（20/40）；对TM、LVF、Netromycin、FO、AMX、CF和ENX等7种药物中介，中介率17.5%（7/40）。其中，头孢类的药物尤为显著，因此，一旦沙门氏菌在伴侣动物之间传播或与人交叉感染时，应进行药物的筛选，选取2～3种敏感或中介药物进行交替治疗，避免耐药菌株的产生。

3.6 分离率

本次分离到沙门氏菌菌株23株，阳性率为18.8%（23/122）。与在本实验室中所做的其他样品（动物性饲料、香肠、火腿肠、猪胴体、牛羊胴体、鲫鱼鳃、仔虾、鸡蛋）中沙门氏菌带菌情况进行比较。结果发现，分离率有着明显的不同。此次的分离率比以前的要明显偏低。分析原因，可能与样品的不同有关。

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