钙敏感受体在颈动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用

李 辛，贺成业，罗俊生，张凤香

辽宁医学院附属第一医院 心外科，辽宁锦州 121001

钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)是G蛋白偶联受体超家族中C家族的一员。CaSR广泛存在于血管系统中如肠系膜动脉、基底动脉、冠状动脉、肾动脉皮下小动脉和主动脉等，并与动脉粥样硬化的形成和发展有密切联系[1]。但CaSR是否存在于颈动脉平滑肌细胞中以及CaSR是否能对颈动脉平滑肌细胞的增殖和迁移产生影响尚不得而知。因此，本实验通过体外培养颈动脉平滑肌细胞，探讨CaSR在颈动脉平滑肌细胞中的表达情况，及其对颈动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响，为颈动脉粥样硬化的防治提供新思路。

材料和方法

1 材料 雄性SD大鼠，100~180 g(武汉大学实验中心)；DMEM、胎牛血清(Hyclone公司)；CaSR激动剂(GdCl3)、CaSR抑制剂(NPS2390)(上海生工)；胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)；兔抗鼠CaSR抗体、兔抗鼠PCNA抗体、兔抗鼠MMP-9、MMP-2抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体、PCR试剂盒、HRP标记山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥公司)。

2 颈动脉平滑肌细胞培养 选取100~180 g雄性SD大鼠，取颈动脉血管中膜，用贴块法分离、培养平滑肌细胞。细胞在含20%胎牛血清的DMEM培养液中培养，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，当平滑肌细胞达到一定密度后，用0.25%胰蛋白酶消化，1∶2传代，取3~6代细胞进行实验。实验分为正常对照组、CaSR激动剂(GdCl3)组及CaSR抑制剂(NPS2390)组。

3 RT-PCR检测CaSR mRNA表达 培养48 h后用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度，参照反转录试剂盒说明书进行反转录反应。反转录PCR法检测；CaSR：forward 5'TCCTGGTTGTCCTAGCTGTC 3'，reverse 5'CAGGCTT TACAAGTGATGAG 3'；β-actin：forward 5'GAAGG TGAAGGTCGGAGTC 3'，reverse 5'GAAGATGGTGAT GGGATTTC 3'。扩增条件 ：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30个循环。取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

4 MTT法检测细胞生长 取对数生长期平滑肌细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为5×104/ml，按每孔200 μl接种于96孔板，24 h后，待细胞融合达80%左右时加药，按正常对照组、CaSR激动剂(GdCl3)组及CaSR抑制剂(NPS2390)组，分别培养24 h、48 h、72 h，每孔加入新鲜配制的浓度为5 mg/ml MTT 20 μl，继续培养4 h。吸去培养液，每孔加入150 μl DSMO，微量振荡器上振荡10 min，室温孵育30 min后放入酶标仪，以490 nm波长检测光密度值(OD)。

5 Transwell实验检测细胞迁移能力 将Matrigel与L-15培养基按1∶4稀释，在Transwell上室中加入40 μl的Matrigel稀释液，37 ℃中孵育12 h，使胶凝固。各组平滑肌细胞用含0.1% BSA的无血清培养基重新悬浮，调整细胞浓度2×105/ml。取100 μl细胞加入上室，500 μl含血清培养基加入下室，每组设3个复孔，于CO2孵箱培养48 h后，取出小室，用棉签蘸取PBS轻轻擦掉上膜细胞，小室以甲醇固定15 min，PBS洗涤3次，每次5 min；结晶紫染色15 min，PBS洗涤3次，每次5 min后镜下观察，每个滤膜随机取5个视野(100×)，取均值计数，照相分析。

6 Western blot检测CaSR、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、MMP-9及MMP-2表达 收集各组细胞以冷PBS洗2次，以裂解缓冲液提取细胞总蛋白，蛋白浓度参照BCA试剂盒测定。煮沸变性的蛋白以每孔40 μg的含量加样，经浓缩胶6%，分离胶10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离。通过电转仪将凝胶上的蛋白样品转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉在37 ℃封闭2 h。分别与1∶600兔抗鼠CaSR和PCNA，1∶1 000兔抗鼠MMP-9及MMP-2抗体4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶500)，4 ℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL发光试剂盒发光显影，凝胶成像。7 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行处理。数据以-x±s表示，各组数据进行正态性和方差齐性检验，两样本的均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 颈动脉平滑肌细胞中CaSR的表达RT-PCR和Westernblot结果显示，CaSR抗体组可见明显条带出现，阴性对照组无任何条带出现，说明颈动脉平滑肌细胞中有CaSR存在(见图1、2)。

2 CaSR对细胞增殖能力的影响 结果显示，与正常对照组相比较，CaSR激动剂(GdCl3)组颈动脉平滑肌细胞体外增殖能力明显增强(P＜0.05)，而CaSR抑制剂(NPS2390)组颈动脉平滑肌细胞体外增殖能力明显减弱(P＜0.05)，说明CaSR的表达与颈动脉平滑肌细胞的增殖能力呈正相关(见表1)。

3 CaSR对细胞迁移能力的影响 培养48 h后各组细胞体外迁移能力的检测，Transwell实验检测结果显示，与正常对照组相比，CaSR抑制剂(NPS2390)组细胞穿过基质胶的数量明显减少(P＜0.05)，而CaSR激动剂(GdCl3)组细胞穿过基质胶的数量明显增加(P＜0.05)，说明CaSR的表达变化可以影响颈动脉平滑肌细胞的迁移能力。见图3。

4 CaSR对MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表达的的影响 与正常对照组相比，CaSR激动剂(GdCl3)组MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表达增强，而CaSR抑制剂(NPS2390)组MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表达减弱。见图3。

表1 CaSR对颈动脉平滑肌细胞体外增殖能力的影响(-x±s，n=6，OD值)

图 1 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定CaSR基因的表达(左)图 2 免疫印迹方法鉴定CaSR蛋白的表达(右)1： CaSR抗体组； 2： 阴性对照组

图 3 Transwell小室实验检测CaSR对颈动脉平滑肌细胞体外侵袭能力的影响与正常对照组比较， CaSR表达的变化可以影响颈动脉平滑肌的迁移能力A： 对照组； B： GdCl3组； C： NPS2390组(aP＜0.05，与正常对照组比较)

图 4 免疫印迹方法鉴定MMP-9， MMP-2和PCNA蛋白的表达A: 对照组； B: GdCl3组； C: NPS2390组

讨 论

颈动脉粥样硬化易形成颈动脉狭窄，从而导致缺血性脑血管病的形成，因此有效预防颈动脉粥样硬化的形成可明显降低缺血性脑血管病的发病率和死亡率。CaSR是由Brown等[2]于1993年从牛甲状旁腺克隆出来的，随后发现CaSR在很多组织细胞中均有表达如甲状旁腺、肾脏、脑等。近年研究发现，在心肌组织中也存在CaSR，并且CaSR还参与了心肌缺血-再灌注损伤和心肌肥大等疾病的发生发展过程[3-5]；Ziegelstein等[6]证实主动脉内皮细胞中存在CaSR的表达；Smajilovic等[7]不但证实主动脉平滑肌细胞存在CaSR的表达，还证实CaSR可以影响主动脉平滑肌细胞的增殖。李光伟等[8-9]证实肺动脉平滑肌细胞中有CaSR的表达，并且CaSR可导致肺动脉平滑肌细胞增殖。但颈动脉平滑肌细胞中是否存在CaSR尚未见报道。

本研究通过RT-PCR和Western blot两种实验方法检测颈动脉平滑肌细胞中是否存在CaSR的表达，实验结果显示：CaSR抗体组有明显条带出现，说明有CaSR的表达；而无CaSR抗体的阴性对照组无任何条带出现，说明无CaSR的表达，该研究结果表明颈动脉平滑肌细胞中存在CaSR的表达。

大量研究已经证实CaSR在动脉粥样硬化的形成和发展过程中起到十分重要的作用。因此，本实验进一步研究CaSR与颈动脉平滑肌细胞的增殖和迁移的关系。本研究首先通过MTT法检测发现，与正常对照组相比较，CaSR激动剂组颈动脉平滑肌细胞体外增殖能力明显增强，而CaSR抑制剂组颈动脉平滑肌细胞体外增殖能力明显减弱。PCNA又被叫做周期蛋白，它参与DNA的合成过程，是判定细胞增殖活性的重要物质，大量研究已经证实PCNA的表达变化与细胞的增殖情况密不可分，两者呈正相关关系[10]。本研究结果发现：CaSR激动剂组PCNA蛋白表达增强，而CaSR抑制剂组PCNA蛋白表达减弱。以上研究结果表明CaSR的表达变化能影响颈动脉平滑肌细胞的增殖能力。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类高度保守的依赖于锌离子和钙离子内切蛋白水解酶家族，MMPs能降解细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)中的各种蛋白成分，能通过降解ECM导致细胞迁移[11]。目前已经发现和纯化的MMPs至少有24种，其中MMP-2、MMP-9在细胞的迁移过程中起到极其重要的作用[12]。本研究Western Blot检测发现，与正常对照组相比CaSR激动剂组MMP-2、MMP-9蛋白表达均增强，而CaSR抑制剂组均减弱；Transwell检测结果显示，与正常对照组相比，CaSR抑制剂组的细胞穿过基质胶的数量明显减少，而CaSR激动剂组则明显增加；说明颈动脉平滑肌细胞的侵袭能力与CaSR的表达有关。

综上所述，颈动脉平滑肌细胞内存在CaSR，并且能影响颈动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，这种影响可能是通过PCNA和MMP-2、MMP-9来实现的，但具体机制还需进一步研究。

1 郭津，徐长庆，李鸿珠，等. 动脉粥样硬化对大鼠心肌钙敏感受体表达和细胞凋亡的影响［J］. 中华心血管病杂志，2008，36（12）：1101-1105.

2 Brown EM， Gamba G， Riccardi D， et al. Cloning and characterization of an extracellular Ca（2+）-sensing receptor from bovine parathyroid［J］. Nature， 1993， 366（6455）： 575-580.

3 Wang R， Xu C， Zhao W， et al. Calcium and polyamine regulated calcium-sensing receptors in cardiac tissues［J］. Eur J Biochem，2003， 270（12）：2680-2688.

4 Sun YH， Liu MN， Li H， et al. Calcium-sensing receptor induces rat neonatal ventricular cardiomyocyte apoptosis［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 350（4）：942-948.

5 Wang LN， Wang C， Lin Y， et al. Involvement of calcium-sensing receptor in cardiac hypertrophy-induced by angiotensinII through calcineurin pathway in cultured neonatal rat cardiomyocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun， 2008， 369（2）： 584-589.

6 Ziegelstein RC， Xiong Y， He C， et al. Expression of a functional extracellular calcium-sensing receptor in human aortic endothelial cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 342（1）： 153-163.

7 Smajilovic S， Hansen JL， Christoffersen TE， et al. Extracellular Calcium sensing in rat aortic vascular smooth muscle cells［J］.Biochem Biophys Res Commun， 2006， 348（4）： 1215-1223.

8 李光伟，邢文婧，郝静辉，等．钙敏感受体在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用［J］.中国病理生理杂志，2010，26（12）：2433-2437．

9 Li GW， Wang QS， Hao JH， et al. The functional expression of extracellular calcium-sensing receptor in rat pulmonary artery smooth muscle cells［J］. J Biomed Sci， 2011， 18：16.

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