TNF-α对肾血管收缩敏感性的影响

郭莲怡，王桂君，史 璇

辽宁医学院附属第一医院 消化科，辽宁锦州 121001

肝肾综合征(hepatorenal syndrome，HRS)是由于严重的肝功能损害及门脉高压所致的急性功能性肾衰竭，是终末期肝病常见的严重并发症之一，肾血管收缩是HRS的主要原因。有研究表明肝硬化时肾脏对缩血管物质的敏感性增强[1]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作为重症肝炎发生的重要因子[2]，与重症感染时肾衰的发生发展明显相关[3]。然而，TNF-α在HRS肾血管收缩中的作用及机制目前还不清楚。本研究应用离体灌注肾技术观察TNF-α预灌流离体大鼠肾脏后，肾血管对内皮素(endothelin，ET)收缩反应性的改变。

材料和方法

1 实验动物 选择清洁级雄性SD大鼠28只，体质量250~300 g。(由辽宁医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(辽)2003-0007，开放系统饲养，实验前禁食12 h)。

2 主要试剂和仪器 TNF-α(Sigma公司)、ET-1(Sigma公司)、2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-APB，Sigma公司)、无钙Kreb's灌流液。Minipuls2灌注泵，法国Gilson；RM6000多导生理记录仪，日本；恒温灌注池，广东；Oxnard CA张力换能器，美国Gould；氧合器，热交换器、HTG恒温器，上海；倒置显微镜，德国Carl Zeiss公司。

3 离体灌注肾实验模型的建立[4]应用戊巴比妥钠(30 mg/kg)经腹腔注射将大鼠麻醉。剪毛，腹壁消毒，正中切开，用棉签分离肠系膜上动脉、右肾动脉、右肾静脉及右侧输尿管。用套管针从肠系膜上动脉插管，经腹主动脉，插入右肾动脉起始部，管外接三通，三通接张力换能器和灌注装置，肾静脉开放。在肠系膜上动脉及右肾动脉主干分别结扎。整个手术过程均在10 min左右完成。左肾取出称重作为对照肾重。灌注过程：在腹主动脉插管至肾动脉时启动灌注泵，开始灌流。灌注液流量恒定为5 ml/min，经热交换器加温至37℃，经氧合器持续给95%氧和5%二氧化碳的混合气，灌流液为一次性，不再循环应用。

4 实验分组 28只大鼠制备离体灌注肾模型后随机分为4组(n=7)，平衡期后(开始灌流5~10 min后，继续稳定20 min，共30 min)，进入正式实验。具体分组：A1组(n=7)：平衡期后，无钙Kreb's液灌流90 min，加ET(1 nmol/L)刺激；A2组(n=7)：平衡期后，用含TNF-α(100 μg/L)的无钙Kreb's液灌流90 min，加ET(1 nmol/L)刺激；B1组(n=7)：平衡期后，用无钙Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB)，加ET(1 nmol/L)刺激；B2组(n=7)：平衡期后，用含TNF-α(100 μg/L)的无钙Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB)，加ET(1 nmol/L)刺激。

5 离体肾体外灌注过程 整个实验过程由多导生理记录仪连续记录肾脏灌注压。实验过程分三个阶段：第一阶段(平衡期)：4组在灌流通路上，均先用无钙Kreb's液灌流30 min，以达到平衡；第二阶段(灌流期)：各组分别用含特定成分的无钙Kreb's液灌流90 min；第三阶段(刺激期)：各组均予含ET(1 nmol/L)的无钙Kreb's液继续灌流20 min。据报道离体肾体外灌流140 min内血流动力学稳定[4]，故整个灌流过程持续时间为140 min。

6 肾脏水肿率及病理检查 灌流结束后，各组肾标本称重，计算肾脏水肿率，肾脏水肿率=(灌流后肾重-对照肾重)/对照肾重。4%的多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋、HE染色观察肾小球及肾小管形态、结构。

7 统计学分析 计量资料(即各组灌注压值)以-x±s表示，各组数据比较采用两独立样本的t检验，P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 对基础灌注压的影响 平衡期过后，各组基础灌注压比较无统计学差异(P＞0.05)。TNF-α、2-APB预灌流时，基础灌注压无明显改变。

2 TNF-α对ET缩血管作用的影响 A1、A2组在应用ET(1 nmol/L)刺激后，肾灌注压较基础压均明显升高(P＜0.05)；A2组灌注压升高值显著高于A1组(P＜0.01)。见图1，表1。

图 1 TNF-α对ET缩血管作用的影响Fig. 1 Effect of TNF-α on renal vasoconstriction by ET

3 阻断IP3R对TNF-α作用的影响 B1、B2组于灌流后期加入2-APB，刺激期用ET(1 nmol/L)刺激，肾灌注压均略升高，但与基础灌注压比较无统计学差异(P＞0.05)；两组灌注压升高值比较无统计学差异(P＞0.05)。见图2，表1。

表1 各组大鼠离体肾灌注压水平Tab. 1 Renal perfusion pressure of each group(mmHg, -x±s, n=7)

4 肾脏水肿率及病理变化 4组肾脏的水肿率分别为28%±2%、29%±3%、28%±3%、27%±2%，且灌流后的肾脏标本切片经HE染色均未发现明显的器质性损伤，与灌流前相符。见图3。

讨 论

重型肝炎和各种原因引起的肝硬化常并发多脏器功能衰竭，尤其当并发HRS时，患者的预后极差，80%~100%的患者在诊断后的1个月内死亡。HRS不同于原发性肾脏疾病的肾衰竭，它缺乏后者所具有的临床、实验室和组织学的改变，目前认为HRS的发生是由于肾血管收缩造成肾脏明显低灌流的结果，其机制尚不完全清楚。当HRS发生时，患者血清中许多缩血管活性物质水平明显增高，并可直接或通过间接途径引起肾血管收缩，是导致肾血流灌注和肾功能紊乱的重要介质[1]。近年来学者们认为：重型肝炎患者血中高浓度的TNF-α是引起多脏器功能衰竭发生的重要因子[2]，许多研究表明TNF-α可通过多种途径引起血管收缩，从而参与相关疾病的病理生理过程：1)TNF-α可通过TNFR2和ET-ETR依赖途径引起血管收缩。TNF-α可通过引起ET产生增多来发挥缩血管作用。当阻断ETA、、ETB受体后，TNF-α就不再有缩血管作用了[5]。2)TNF-α抑制内皮依赖的一氧化氮-环磷酸鸟苷(NO-CGMP)途径导致血管收缩。首先TNF-α通过活化蛋白激酶C(PKC)抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化从而抑制eNOS的活性；同时TNF-α可通过缩短eNOS mRNA的半衰期来下调eNOS mRNA[6]。3)TNF-α可增强Ca2+依赖及非Ca2+依赖蛋白激酶活性，增强血管平滑肌细胞收缩[7]。

本实验发现：肾脏经含TNF-α的无钙Kreb's液灌流后，其肾血管对ET的反应提高，表现为肾血管灌注压明显高于非TNF-α处理组。结果显示：TNF-α可增强ET引起的肾血管收缩。

肾血流量受血管平滑肌的收缩和舒张调节，而血管平滑肌的收缩和舒张又受平滑肌细胞内Ca2+调节。细胞内Ca2+增加受两个作用机制来调控[8]：一方面胞外Ca2+进入胞内：各种刺激，如膜电压改变、受体结合、第二信使及机械刺激都可以使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起胞外Ca2+大量内流；另一方面胞内钙库释放Ca2+：各种刺激使肌浆网(内质网)膜上的钙释放通道开放，引起细胞内储备Ca2+的释放。本实验中应用无钙Kreb's液灌流肾脏，不存在胞外Ca2+内流这一因素，因此实验结果也表明：TNF-α可通过促进胞内钙释放进而增强ET的肾血管收缩作用。

已知ET等血管活性物质与靶细胞膜上特异性受体(如ET受体)结合后，使膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸发生磷酸化生成IP3，IP3与IP3R(胞内主要的Ca2+释放通道)结合则促进细胞内Ca2+释放，使胞内Ca2+水平增高[9]，引起细胞收缩。2-APB是一种常用的IP3R的阻断剂，可特异性阻断IP3R[10]，本实验应用含2-APB及TNF-α的无钙Kreb's液灌流肾脏，其肾血管对ET的反应较差，ET刺激后的肾血管灌注压无显著变化。结果表明：2-APB可阻断TNF-α的前述作用，说明TNF-α可能通过上调IP3R进而增强ET引起的肾血管收缩。

已有研究报道：TNF-α可诱导肾小球纤维蛋白沉积、中性粒细胞浸润、细胞凋亡，引起GFR下降。因此实验结束后，所有的肾脏标本称重，计算其水肿率＜30%，说明灌流成功；并进行常规病理检查均未发现肾小管及肾小球细胞病理性改变，故排除了实验结果受器质性肾脏损伤影响的因素[11]。

综上所述，重症肝炎患者血中存在的高浓度TNF-α可能上调IP3R，促进胞内钙释放，诱导肾入球动脉平滑肌收缩性增强，肾入球动脉收缩，造成肾血流减少，参与HRS发生。

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