染色体荧光原位杂交快速产前诊断染色体数目异常

姜淑芳，卢彦平，付玉荣，汪淑娟，张立文，李亚里，高志英

解放军总医院 妇产科，北京 100853

产前诊断(prenatal diagnosis)染色体病是降低胎儿出生缺陷，提高人口素质的重要措施之一。目前，约80%的产前染色体核型分析都是因唐氏综合征筛查高风险而进行的[1]，细胞培养及染色体核型分析是确诊染色体病的重要手段，被誉为诊断染色体病的金标准。但由于需较长时间细胞培养，报告结果所需时间较长，孕妇易产生焦虑情绪；有时因为细胞培养失败、核型少或染色体分散差而不能得出分析结果。同时，染色体核型分析可以发现目标疾病以外的染色体异常，特别是某些并无明显临床表型改变的染色体结构异常，从而使产前咨询变得更加繁杂。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是20世纪80年代中期发展起来的非放射性原位杂交技术。其原理是将荧光素标记的探针与变性后的染色体、细胞、组织中的核酸按照碱基互补原则进行杂交，经洗涤后直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下观察，不同的探针标记的荧光素颜色不同，从而可以在荧光显微镜下加以区分。由于产前诊断中80%以上与临床相关的染色体异常是常见的染色体非整倍体异常[2]，因此针对这几种染色体的FISH技术逐步应用于临床产前诊断中。但是，该技术在产前诊断中如何应用，国内外一直有不同的观点[1,3-4]。本研究分析比较494例羊水或脐带血样本的产前诊断结果，探讨染色体荧光原位杂交及其联合核型分析在产前诊断常见染色体异常中的应用价值。

资料和方法

1 临床资料 2010年4月-2012年8月来我院产科门诊进行产前诊断的孕妇494例，年龄19~48岁(平均33.6岁)，孕周15+1~34周(平均20+4周)，均为中孕期母血清筛查结果显示高危、晚孕期超声发现异常、高龄或其他产前诊断指征者，经详尽的产前咨询，签署知情同意书后，实施羊膜腔穿刺或脐静脉穿刺。

2 标本采集 在超声引导下行常规穿刺术，抽取羊水或脐血。最先抽出的约2 ml羊水弃掉，再抽取羊水25 ml，无菌条件下注入3支尖底离心管中，每支分别为10 ml、10 ml、5 ml，分别用于细胞培养和FISH。脐血样本约2 ml，分两管，肝素抗凝。所有羊水和脐血样本及时送检，及时处理。

3 细胞培养及染色体核型分析 按照产前诊断技术行业标准和规范[5-6]，将两管各约10 ml的羊水样本，离心2 500 r/min，10 min，弃上清液，每管留沉渣约0.5 ml，分别加Gibco羊水培养基4 ml，吹冲混匀后接种2瓶细胞培养瓶中，分别置37 ℃、5% CO2孵箱中独立培养，根据细胞生长状况进行换液，并将上清液合并至一新培养瓶中，三瓶细胞继续培养适当时间。按原位方法收获细胞，经老化、显带、染色等处理后进行染色体核型分析。计数15个细胞染色体数目，分析3~5个克隆的染色体，每个克隆分析配对一个分裂相，并保存核型图。脐带血染色体核型分析同常规外周血操作，计数20个分裂相，选择2~3个进行分析配对并保存。

4 荧光染色体原位杂交 参照试剂盒说明书和分子细胞遗传学技术与应用指南[7]进行操作。将约5 ml羊水细胞样本置于15ml尖底离心管中，1 200 r/min，离心10 min，去上清，加入5 ml预热至37 ℃的氯化钾(KCl)溶液进行低渗处理。脐血样本0.5 ml直接加入5 ml预热至37 ℃的KCl溶液进行低渗处理。再经固定液(甲醇∶冰醋酸，3∶1)固定后制成细胞膜片，经消化后，用GLP 13/GLP 21组和CSP18/ CSP X/ CSP Y组探针进行杂交，再经洗涤与复染后，立即盖上盖玻片。暗处放置10~20 min后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察细胞数量和分布，随机计数至少50个细胞的杂交信号，90%以上的细胞显示GLP 13/GLP 21组：21号染色体为2个红色荧光点，13号染色体2个绿色荧光点；CSP18/ CSP X/ CSP Y探针组：18号染色体为2个天蓝色荧光点，若X显示2个绿色荧光点，为女性；X显示1个绿色荧光点，Y显示1个红色荧光点，为男性；均视为未见异常。60%以上的细胞出现异常信号，多或者是少，则判断为相应的染色体数目异常。必要时，可增加计数细胞数，甚至浏览全片。

结 果

1 羊水或脐血样本的染色体核型分析 结果报告时间平均为4~5周，分析成功率为99.60%(492/494)；染色体异常发生率为8.74%(43/492)；数目异常占异常总数的81.40%(35/43)，结构异常占18.60%(8/43)。在数目异常中，21三体占74.29%(26/35)，18三体17.14%(6/35)，性染色体数目异常8.57%(3/35)。见表1。

2 染色体荧光原位杂交检测结果 报告时间平均为72~96 h，分析成功率为100%(494/494)，染色体异常发生率为7.09%(35/494)，均为数目异常(表1)，其中21三体(见图1A)占数目异常的74.29%(26/35)，18三体(见图1B)17.14%(6/35)，性染色体数目异常(见图1C、D、E)8.57%(3/35)。

3 荧光染色体原位杂交与核型分析检测常见染色体数目异常比较 FISH能够检测出所有的21、18和性染色体的数目异常，与染色体核型分析方法相比，结果完全相符。见表2。

表1 染色体核型分析和FISH检测结果Tab.1 Findings in chromosome karyotype analysis and FISH

图 1 FISH检测染色体数目异常 A： 21三体； B: 18三体； C： XXY； D： XYY； E： XOFig. 1 FISH showing abnormal chromosomes A: trisome 21; B: trisome 18; C: XXY; D: XYY; E: XO

表2 荧光染色体原位杂交与核型分析检测结果比较Tab. 2 Findings in FISH and chromosome karyotype analysis

讨 论

许多研究证明，利用18、X、Y染色体的着丝粒α卫星探针和13、21染色体的特异序列探针快速检测羊水细胞中13、18、21、X和Y染色体的数目异常，进行产前诊断是快捷有效的，可减轻等待分析结果给孕妇带来的焦虑情绪。该技术的检测敏感性和特异性分别为83%~100%和99.8%~100%[8]，被誉为快速核型分析技术(rapid aneuploidy detection，RAD)，随着探针的商品化和认证，FISH在产前诊断中逐步开始应用。但是，关于如何应用，国内外一直有不同意见，归纳为四种[9]：一是单独只用染色体核型分析；二是RAD联合染色体核型分析；三是让孕妇自行选择RAD或染色体核型分析；四是只用RAD。2000年，美国医学遗传学学院和美国人类遗传学会发表声明，认为间期核FISH技术对产前诊断和筛查染色体异常有高敏感性和准确性，可提供非常准确的结果。阳性FISH结果具有诊断参考价值。胎儿临床管理的最终决定需依据以下三个条件中的任意两条：阳性FISH结果、确定的染色体分析结果或一致的临床信息。在临床诊疗实践中，有学者报道[10]，72%的胎儿染色体异常的孕妇选择了根据FISH结果和超声检查结果引产，而没有等待核型分析结果。2004年，英国国家筛检委员会(UK National Screening Committee，UKNSC)则推荐，针对唐氏综合征产前筛选检查结果高风险或高龄、超声显示胎儿结构正常的孕妇，可以采用FISH等快速诊断方法直接进行产前诊断。

目前，国内已有常见非整倍体异常的商品化探针，许多实验室具备了所需设备，熟练掌握了操作技术，因此，间期核FISH应用于临床产前诊断，已较为普及。本研究中，FISH能够检测出所有的21、18和性染色体的数目异常(占异常总数的81.40%)，与染色体核型分析方法相比，结果完全相符。与Neagos等[11]研究结果是一致的。但是，由于FISH技术本身固有的技术局限性，只能检测探针对应的染色体异常，而未能检测出8例结构异常。目前的产前筛查目标疾病主要是21三体、18三体、13三体和开放性神经管缺陷，其中，开放性神经管缺陷主要依赖于超声检查。因此，可以认为，针对常见染色体异常(13、18、21、X、Y的非整倍体异常)，间期核快速FISH可直接单独应用于产前诊断，既简便、快速，又避免了因为染色体核型分析发现的部分无明显表型改变的结构异常。在染色体异常率高发的情况下，如超声显示胎儿结构异常、高龄、父母为染色体异常携带者等，FISH应与传统的染色体核型分析相结合，一方面利用FISH快速检测常见染色体异常，提高分析的速度和效率，减轻孕妇的精神负担，同时应用经典的染色体核型分析技术保证检测结果的全面、准确、可靠。

在产前诊断中，染色体嵌合体问题也是备受关注的问题。FISH能够检出部分嵌合体。而某些嵌合体，特别是低比例的嵌合体，难以检测出来，而这种低比例的嵌合体存在的意义值得临床探讨，特别是超声显示胎儿结构正常时，染色体嵌合体的问题更是产前咨询中的棘手问题。而在临床实践中，羊水细胞染色体核型分析提示的嵌合体，经脐血细胞核型分析复检为正常的例子也屡见不鲜。赵欣荣等[12]发现，羊水细胞染色体核型分析为46，XY[42]/47，XY，+8[12]的嵌合体，经脐血细胞核型分析复检为正常，由于孕妇为高龄，超声检查胎儿正常，经遗传咨询后，孕妇要求继续妊娠。因此在为孕妇进行产前诊断时，详尽的咨询工作十分重要。无论是选择FISH，还是FISH联合细胞染色体核型分析检查，在咨询时，都要充分告知技术的优越性和局限性，而对于检验结果的解读也是重要的产前诊断环节。

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10 Bryndorf T， Lundsteen C， Lamb A， et al. Rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidies by interphase fluorescence in situ hybridization： a one-year clinical experience with high-risk and urgent fetal and postnatal samples［J］. Acta Obstet Gynecol Scand，2000， 79（1）： 8-14.

11 Neagos D， Cretu R， Sfetea RC， et al. The importance of screening and prenatal diagnosis in the identification of the numerical chromosomal abnormalities［J］. Maedica（Buchar）， 2011，6（3）：179-184.

12 赵欣荣，吴怡，韩旭，等．荧光原位杂交产前诊断染色体异常的临床应用［J］.中国优生与遗传杂志，2012，20（5）：46-47.