泽泻指纹图谱研究

李行诺，马 旭，楚 楚，金辉辉，杨 阳，颜继忠

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

泽泻指纹图谱研究

李行诺，马 旭，楚 楚，金辉辉，杨 阳，颜继忠

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

建立泽泻饮片的高效液相指纹图谱，研究不同购买地泽泻饮片的质量，为科学评价及有效控制其质量提供参考.使用Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱，以乙腈－水为流动相采用梯度洗脱法进行色谱分离.11批样品得到的色谱指纹图谱有25个共有峰，其中3，5，6，8，10，12号峰分别被鉴定为泽泻醇F，24-乙酰泽泻醇F，23-乙酰泽泻醇E，24-乙酰泽泻醇A，25-去羟基泽泻醇A，11-去氧泽泻醇A.首次使用泽泻中多个三萜类成分作为对照品对指纹图谱色谱峰进行指认，结果重现性好，为控制泽泻饮片的质量提供可靠的分析方法.

泽泻；指纹图谱；高效液相

泽泻（Alismaorientalis）为泽泻科泽泻属植物的干燥块茎.味甘，性寒，归肾、膀胱经.具有利小便、清湿热等功效.用于小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋涩痛等症［1］.现代药理学研究表明：泽泻具有利尿、降血脂和降血压等功效［2］，其主要药效成分为原萜烷型四环三萜类化合物，种类较多，因此质量控制也更为困难.历年来也有不少学者做过泽泻指纹图谱的研究［3－6］，为泽泻的进一步研究提供了非常有价值的实验依据.本实验以泽泻饮片为实验材料，通过高效液相色谱法研究并建立其指纹图谱，并通过已经建立的指纹图谱方法对11批不同购买地的泽泻饮片进行研究，利用与对照品对比的方法，对指纹图谱中的6个主要色谱峰进行了指认.该方法首次使用泽泻中的多个原萜烷型四环三萜类［7］成分作为对照品对泽泻指纹图谱色谱峰进行指认，可用于泽泻药材、饮片及提取物中三萜类成分的定性质量评价，为泽泻及其制剂质量标准的制订提供补充.

1 实验材料

1.1 材料、仪器与试药

1.1.1 材 料

11批饮片购自各地药店，来源见表1，均由楚楚博士鉴定为正品，留样保存于浙江工业大学药学院.泽泻醇F，24-乙酰泽泻醇F，23-乙酰泽泻醇E，24-乙酰泽泻醇A，25-去羟基泽泻醇A，11-去氧泽泻醇A为对照品，由本实验室分离制备所得.

表1 11批泽泻药材信息表Table 1 Information of 11 samples of Alismaorientalis

1.1.2 仪器和试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；RE2000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；JA2003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；有机针筒过滤器，直径13 mm，孔径0.45μm（上海兴亚净化材料厂）；Millipore Q-7纯水仪（美国 Millipore公司）；KQ3200型数控超声仪超声仪（昆山市超声仪器有限公司）.

对照品泽泻醇F，24-乙酰泽泻醇F，23-乙酰泽泻醇E，24-乙酰泽泻醇 A，25-去羟基泽泻醇 A，11-去氧泽泻醇A均为自制（经核磁和质谱鉴定，采用峰面积归一化法计算，纯度均大于98%）；甲醇为分析纯（上海陆都化学试剂厂），乙腈为色谱纯（美国Tedia公司），水为超纯水.

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱 柱：Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1 mL／min；检测波长：210 nm；进样量：20μL；柱温：35℃；记录时间：90 min；流动相：乙腈—水，按表2的条件进行梯度洗脱.数据处理软件使用国家食品药品监督管理局采用的“中药指纹图谱相似度计算软件（2004A）”进行数据处理.1.2.2 对照品溶液的制备

取泽泻醇F，24-乙酰泽泻醇F，23-乙酰泽泻醇E，24-乙酰泽泻醇 A，25-去羟基泽泻醇 A，11-去氧泽泻醇A对照品，精密称定.用色谱甲醇配制成质量浓度均为1.0 g／L的对照品溶液，冷藏备用.

表2 高效液相色谱流动相条件Table 2 Mobile phase of the HPLC

1.2.3 供试品溶液的制备

泽泻饮片粉碎，过80目筛，取粉末2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL超声提取45 min，过滤，旋蒸得浸膏.加少量甲醇溶解，转移至容量瓶中，定容至5 mL.用0.45μm有机微孔膜过滤，取过滤液，即得.

1.2.4 方法学考察

取同一份供试品溶液，按1.2.3方法处理，按1.2.1色谱条件重复进样6次进样测定进行精密度考察.取同一批样品6份，按1.2.3方法制备供试品溶液，按1.2.1色谱条件重复进样6次进样测定进行重复性考察.取同一批供试品溶液，按1.2.3方法处理，按1.2.1色谱条件分别在0，2，6，12，24，48 h进样测定进行稳定性考察.

1.2.5 泽泻指纹图谱的建立

按1.2.3方法制备11批泽泻提取物供试品溶液，在1.2.1色谱条件下依次进样测定，并记录90 min内的色谱图.按1.2.2方法制备泽泻对照品溶液，按1.2.1色谱条件进样测定.泽泻提取物供试品溶液色谱图，如图1所示.泽泻对照品溶液色谱图，如图2所示.11批泽泻提取物样品色谱峰叠加图，如图3所示.

2 结果与讨论

2.1 泽泻供试品的精密度、重复性和稳定性

供试品溶液中各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.15%和2.9%以内，各指纹图谱相似度都在0.95以上，说明仪器精密度良好，泽泻供试品溶液的重复性良好且在48 h内稳定性.符合色谱指纹图谱研究技术的要求.

2.2 参照峰的选择

根据图1可以看出色谱图各峰的峰强度有很大差异，其中1—3，5—12，14，15，19，22，23号峰峰形及分离度较好，确定这16个峰为共有峰.通过与对照品对照，指认了其中6个色谱峰.即3号峰为泽泻醇F，5号峰为24-乙酰泽泻醇F，6号峰为23-乙酰泽泻醇E，8号峰为24－乙酰泽泻醇A，10号峰为25－去羟基泽泻醇A，12号峰为11-去氧泽泻醇A.

2.3 指纹图谱技术参数

将11批饮片的HPLC图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件进行数据处理.以S5批饮片谱图作为参照谱进行指纹匹配，计算样本图谱与对照图谱的相似度，对11批药材共有峰的相对保留时间与相对峰面积进行计算，结果如表3所示.由表3可知：11批泽泻药材的保留时间RSD在0.28%以内变化较小，峰面积RSD变化较大，表明各地泽泻饮片化学成分的含量存在一定差异.

表3 11批泽泻样品色谱图共有峰的保留时间和峰面积1）Table 3 HPLC fingerprint of retention time and peak area of 11 samples of Alisma orientalis

2.4 色谱条件的考察

实验中考察不同提取溶剂对指纹图谱的影响，最终发现甲醇超声提取45 min，回收溶剂并用甲醇定容出峰最多.以甲醇—水，乙腈—水作为流动相，通过调整溶剂比例进行检测，由色谱图比较可知甲醇－水体系基线漂移很严重且各色谱峰相互重叠较多，没有达到分离的效果；乙腈－水体系出峰比较多，基线较平，色谱峰分离度较好，因此选择以不同比例的乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱.对不同色谱柱的分离效果进行了考察，考察了Agilent Zorbax Eclipse-C18，Zorbax Extend-C18，Zorbax SB-C18色谱柱对提取物的分离情况，综合分离度、峰形、稳定性及使用范围等各种因素，选用Zorbax Extend-C18色谱柱较为合适.考察了不同波长对图谱的影响，在210 nm处特征峰响应较高，色谱峰信息量最大，而这也是泽泻中三萜类化合物主要的吸收波长.

3 结 论

在摸索了大量色谱条件的前提下，建立了泽泻的指纹图谱.最终确定采用HPLC法进行测定，色谱柱为 Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速为1 mL／min，检测波长为210 nm，进样量为20μL，柱温为35℃，记录时间为90 min，流动相为乙腈—水.首次使用多个原萜烷型四环三萜类化合物作为对照品对泽泻指纹图谱色谱峰进行指认，实验的研究结果经方法学考察，重现性强，精密度与稳定性好，可用于泽泻药材、饮片及提取物中三萜类成分的定性质量评价，为泽泻及其制剂质量标准的制定提供补充.

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：化学工业出版社，2005：158.

［2］徐晖.泽泻药理作用研究进展［J］.湖南中医杂志，2004，20（3）：77.

［3］刘红昌，杨文钰，陈兴福.四川道地药材泽泻指纹图谱的建立及其质量研究［J］.中国中药杂志，2007，432（18）：1844-1847.

［4］巩丽萍，王少云，张克.泽泻饮片的HPLC-ELSD指纹图谱研究［J］.中药新药与临床药理，2007，18（6）：461-464.

［5］许丹，杨松松.泽泻指纹图谱的初步研究［J］.时珍国医国药，2003，14（12）：727-728.

［6］LIU Xin，LI Song-lin，ZHOU Yan，et al.Characterization of protostane triterpenoids inAlismaorientalisby ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-offlight mass［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24：1514-1522.

［7］朱玉岚，彭国平.泽泻的萜类化学成分研究进展［J］.天然产物研究与开发，2006，18（4）：348-351.

Research of chromatographic fingerprint on Alisma orientalis

LI Xing-nuo，MA Xu，CHU Chu，JIN Hui-hui，YANG Yang，YAN Ji-zhong
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

To develop a HPLC method of the chromatographic fingerprint ofAlismaorientalisfor quality control.The HPLC chromatographic profiles were determined on the Zorbax Extend-C18Column（250 mm×4.6 mm，5μm）eluted with the mobile phases of water and acetonitrile in gradient mode.The HPLC chromatographic fingerprint with 25 common peaks was established from 11 lots ofA.orientalis.Six peaks were identified as alisol F，24-acetyl alisol F，23-acetyl alisol E，24-acetyl alisol A，25-dehydroxy alisol A and 11-deoxyalisol A.The HPLC fingerprint method is repeatable，feasible for the quality control ofA.orientalisand the preparations.

Alismaorientalis；chromatographic fingerprint；HPLC

R284.1

A

1006-4303（2013）02-0143-04

2012-03-16

浙江省教育厅科研项目（Y200908190）；浙江工业大学“大学生创新性实验计划”项目（2010036）

李行诺（1981—），男，河南荥阳人，讲师，博士，中药药效物质基础及质量控制研究，E-mail：li＿xingnuo＠yahoo.com.cn.

（

陈石平）