丁香酚与硫氢化钠促进番茄幼苗侧根生长

徐庆宣，陈 健，黄晓芳，陈 浩，叶 敏，石志琦

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650000;2.江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，江苏 南京 210014)

侧根是植物根系的重要组成部分，对养分吸收、锚定植株以及植株抗病方面起关键作用。侧根的生长发育是遗传因子和外部生物及非生物因素共同刺激作用的结果。许多外界环境因素如光照、温度、二氧化碳、水分、营养元素、外源植物激素等都可影响到侧根的生长［1-3］。丁香酚(Eugenol，4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是植物丁香挥发油的主要成分，具有抗氧化、杀菌消炎、解热、麻醉、防腐、驱蚊等效果。陈浩等研究发现丁香酚对西葫芦病毒病具有较好的防治效果，可以有效缓解染病植株叶片皱缩、矮化等症状［4］;苏杭等研究结果表明丁香酚通过诱导烟草植株系统获得抗性抗烟草花叶病毒病，并可以提高烟草植株叶绿素含量，说明丁香酚可通过调控植株生长抵抗病原菌侵染［5-7］。对于植物提取物促进侧根发生活性已有报道［8］，进一步研究丁香酚促进植物侧根的发育机理将有助于明确丁香酚对植物生长的调节作用。

硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后发现的植物体内第三种气体信号分子。最近的研究结果表明，H2S参与调控植物多种生理过程，如气孔运动、不定根发育、增强光合作用、缓解干旱、渗透和金属离子等多种非生物胁迫造成的伤害，且 Ca2+可作为 H2S下游信号发挥作用［9-12］。丁香酚是否并怎样通过H2S调控植物侧根发育值得深入研究。

本试验以番茄为供试植株，研究丁香酚和H2S供体NaHS对番茄幼苗侧根发生的影响，以及H2S清除剂对丁香酚和NaHS调控侧根发生过程的影响。同时，根据根尖细胞内Ca2+的响应情况，研究丁香酚调控侧根生长可能的信号响应途径。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

番茄品种苏红2003，购于江苏省农业科学研究院种子店;H2S供体硫氢化钠 (NaHS)、H2S清除剂亚牛磺酸 (Hypotaurine，HT)均购自 Sigma公司;Ca2+荧光染料Flour-3 AM购于海门碧云天生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。智能光照培养箱由宁波江南仪器厂生产。

1.2 试验方法

1.2.1 植物培养 选取饱满的番茄种子经5.0%次氯酸钠(NaClO)消毒15 min后，用蒸馏水冲洗3～4次，于25℃黑暗中催芽，待根长为2～3 cm时挑选生长一致的番茄幼苗转移培养槽光照培养箱中培养。光周期为14 h，温度为25℃，每隔24 h更换1次Hoagland营养液。Hoagland营养液配方为NH4H2PO428.700 μmol/L，Ca(NO)2164.100 μmol/L，KNO3151.650 μmol/L，MgSO460.190 μmol/L，H3BO30.710 μmol/L，CuSO40.020 μmol/L，FeSO4·7H2O 1.330 μmol/L，MnSO4·H2O 0.604 μmol/L，MoO30.004 μmol/L，ZnSO40.055 μmol/L，各种盐类单独配置1000倍贮备液，用时稀释，最后pH值调整到5.5。

1.2.2 番茄侧根数目的统计 挑选根长一致且尚未长出侧根的番茄幼苗转移到Hoagland营养液中。(1)首先设定处理液浓度:丁香酚［0 μmol/L(对照)、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L］，NaHS ［0 μmol/L(对照)、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L］，统计番茄幼苗侧根数;(2)根据上述试验结果，选取促进番茄侧根生长效果最好的处理液(丁香酚和NaHS)分别处理番茄幼苗，每隔24 h统计番茄幼苗侧根数;(3)根据上述试验结果，选取促进番茄侧根生长效果最好的处理液(丁香酚和NaHS)分别添加H2S清除剂200 μmol/L HT后处理番茄幼苗，统计番茄幼苗侧根数。以上每个处理各30株苗，并设有3个重复，结果用Excel软件进行统计分析。

1.2.3 Ca2+荧光检测 将番茄根部切下，迅速吸干表面水分，然后浸入Flou-3 AM探针液内，避光放置30 min后，用蒸馏水冲洗根部，吸干表面水分，在荧光电子显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 丁香酚和硫氢化钠(NaHS)对番茄侧根生长的影响

将番茄幼苗转移到不同浓度的丁香酚和NaHS处理液中，培育5 d后，发现丁香酚和NaHS促进番茄侧根生长呈现明显的浓度效应。随着丁香酚浓度的升高，番茄幼苗侧根数目呈先增加后减少趋势。当丁香酚浓度为5～35 μmol/L时，番茄幼苗平均侧根数目显著高于对照(P＜0.05);其中30 μmol/L丁香酚处理下的番茄幼苗平均侧根数目最多，比对照高出60%左右。随着丁香酚浓度的继续升高(60 μmol/L和120 μmol/L)，番茄幼苗平均侧根数目与对照间差异不显著。NaHS作为H2S供体，可以给植株提供外源H2S。随着NaHS浓度的升高，番茄幼苗侧根数目呈先增加后减少趋势。当NaHS浓度为10～40 μmol/L时，番茄幼苗平均侧根数目显著高于对照(P＜0.05);其中15 μmol/L NaHS处理下的番茄幼苗平均侧根数目最多，为对照的2倍。随着NaHS浓度的继续升高(80 μmol/L)，番茄幼苗平均侧根数目与对照间差异不显著(图1)。

选取30 μmol/L丁香酚和 15 μmol/L NaHS 分别处理番茄幼苗，每隔24 h统计其侧根数目。结果(图2)发现30 μmol/L丁香酚处理的番茄幼苗平均侧根数目随着处理时间延长而增加，且不同处理时间下番茄幼苗平均侧根数目均显著高于对照(P＜0.05)。表明，丁香酚对番茄侧根发生的影响有明显的浓度和时间效应。同样，15 μmol/L NaHS处理下番茄幼苗平均侧根数目随着处理时间延长而增加，且不同处理时间下番茄幼苗平均侧根数目均显著高于对照(P＜0.05)。

图1 不同浓度丁香酚和硫氢化钠处理对番茄幼苗侧根生长的影响Fig.1 The effects of different concentrations of eugenol and NaHS on the growth of tomato lateral root

图2 30 μmol/L丁香酚和15 μmol/L NaHS处理对番茄幼苗侧根生长的时间效应Fig.2 The time-dependent effect of 30 μmol/L eugenol and 15 μmol/L NaHS on the growth of tomato lateral root

2.2 H2S清除剂亚牛磺酸(HT)对丁香酚和硫氢化钠调控番茄幼苗侧根生长的影响

为了进一步研究丁香酚与H2S信号的关系在促进番茄幼苗侧根生长过程中的作用，我们检测了H2S清除剂HT对丁香酚和NaHS促进番茄幼苗侧根生长的影响。结果表明，30 μmol/L丁香酚和15 μmol/LNaHS处理下番茄幼苗侧根数目均显著高于对照、30 μmol/L 丁 香 酚 +200 μmol/L HT、15 μmol/LNaHS+200 μmol/L和 200 μmol/L HT 处理(P＜0.05)。这说明H2S清除剂HT能够减弱丁香酚和NaHS促进番茄幼苗侧根生长的效应，表明H2S可能作为下游信号介导了丁香酚对侧根生长的促进效应 (图3)。

图3 H2S清除剂亚牛磺酸(HT)对丁香酚和NaHS促进侧根生长的影响Fig.3 The effect of H2S scavenger HT on eugenol-and NaHS-promoted growth of tomato lateral root

2.3 丁香酚和硫氢化钠(NaHS)处理对番茄幼苗根内源Ca2+的影响

Ca2+原位荧光检测结果显示，番茄侧根从侧根原基发生到侧根形成过程中都有Ca2+积累(图4)，说明Ca2+对于番茄幼苗侧根的发生必不可少。进一步的研究结果(图5)显示，丁香酚 (30 μmol/L)和NaHS(15 μmol/L)处理均能促进番茄根内Ca2+积累，而加入H2S清除剂HT后，显著抑制了丁香酚促进Ca2+积累的效应。这说明，在丁香酚促进侧根发育的过程中，Ca2+可能作为H2S的下游信号发挥作用。

图4 番茄侧根发育过程中内源Ca2+积累的荧光染色显示Fig.4 Fluorescent staining of endogenous Ca2+during the development of tomato lateral root

3 讨论

图5 不同处理下番茄根细胞内Ca2+积累的荧光染色显示Fig.5 Fluorescent staining of Ca2+in tomato root with different treatments

近年来，植物生根剂作为农药中的一大重要类群，已广泛应用于农、林、园艺等生产中，发挥了重要的作用。植物是天然化合物的宝库，因此，从植物中寻找促生根活性物质，对开发新型高效、安全、与环境友好的生根剂具有重要意义［13］。了解天然化合物调控植株根发生机理，对开发和应用植物源生根剂有很好的指导意义。而目前，丁香酚研究主要集中于抗病性研究，关于其促侧根活性，国内外尚未见报道。

本研究结果显示30 μmol/L丁香酚处理的番茄幼苗平均侧根数高出对照60%，具有很好的促侧根活性。后续试验发现丁香酚促侧根活性可以被H2S清除剂HT抑制，由此推测丁香酚调控番茄侧根发生与H2S信号相关。Lin等研究结果表明，H2S供体NaHS可以诱导黄瓜幼苗不定根的产生［14］;Zhang等发现H2S可以促进切根甘薯、旱柳和大豆幼苗不定根的发生［15］，由此可以看出，H2S信号响应在植物侧根发育过程中普遍存在，而且可以通过NaHS添加外源H2S信号调控植株的侧根发育活性;而低浓度的NaHS可以促进番茄侧根的发生，因此，可以初步确定丁香酚通过H2S信号途径调控番茄侧根的生长。

Ca2+作为植物细胞内的第二信使，参与众多生理过程。细胞质中Ca2+浓度的变化是行使其信使功能的基础。有文献报道Ca2+对拟南芥、水稻、莴苣幼苗有促进侧根形成的作用，通过NaHS预处理烟草、蚕豆细胞可以致使细胞内Ca2+浓度大幅度上升，发挥生理调控作用［16-19］。本研究结果也显示番茄侧根发生过程与细胞内Ca2+浓度密切相关，而丁香酚和NaHS都可以通过显著提高根尖细胞内Ca2+水平促进侧根发生，并且这种作用可以被H2S清除剂HT抑制。由此我们可以推断丁香酚作用番茄幼苗根细胞，介导了根细胞内H2S信号途径，从而导致细胞外Ca2+内流或胞内Ca2+库中Ca2+的释放，使胞内Ca2+水平升高，Ca2+进一步激活下游信号，诱导了侧根发生。

本研究初步阐明了丁香酚促进侧根发生的部分机理，同时也为H2S参与植物侧根发育提供了新的理论证据，但关于丁香酚如何调控H2S信号以及H2S与Ca2+信号的互作还有待进一步研究。

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