NO供体SNP对酸雨胁迫下龙眼种子萌发及生理特性的影响

刘建福，钟书淳，王奇志，王明元，唐源江，杨 晨

(华侨大学生物工程与技术系，福建 厦门 361021)

一氧化氮(Nitric oxide，NO)作为一种新的植物生长调节信号分子，广泛存在于植物组织中，并参与植物呼吸作用、光形态建成、种子萌发、衰老、逆境响应、细胞程序性死亡以及抗病防御反应等过程［1-3］。作为防御响应中的关键信使，NO在缓解种子萌发过程中的盐胁迫［4-8］、水分胁迫［9］、渗透胁迫［10-11］和重金属胁迫［12］等非生物胁迫中起到重要作用。NO作为信号分子在植物抗逆性中的作用越来越受到重视，而外源NO对龙眼的种子萌发及其生理效应的研究未见报道。本试验研究不同pH模拟酸雨对龙眼种子萌发的影响，以及在pH 3.5酸雨胁迫下外源NO供体硝普钠(SNP)对龙眼种子萌发、幼苗生长和生理特性的影响，为NO应用于龙眼的抗酸雨研究提供科学依据，以及为耐酸雨植物的引种驯化种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2012年9月挑取籽粒饱满、大小一致和无病虫害的“福眼”龙眼果实，剥壳去肉，得到种子，用清水漂洗，以0.3%H2O2消毒10 min，并用去离子水冲洗数次。晾干备用。

1.2 试验设计

1.2.1 酸雨胁迫下龙眼种子萌发试验 按SO2-4∶NO3-=5∶1体积比配制酸雨母液［13］，酸雨胁迫程度分别设计为 pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5和 pH 5.0，以 pH 6.5作为对照(CK)，共设8个处理，每个处理设3次重复。种子置于塑料杯(高7.5 cm×直径11.5 cm)中进行发芽。塑料杯底部有3个直径2～3 cm的排水孔，播种时先在塑料杯内铺上双层纱布，装入5 cm厚的干燥河沙，在每个塑料杯中放入20粒龙眼种子，再覆盖1 cm厚的干燥河沙，然后每个处理加入25 ml不同 pH 值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和6.5)模拟酸雨溶液，湿透塑料杯中的河沙，每杯为1个重复，每个处理3杯，最后置于25℃恒温培养箱中培养。光照时间为12 h/d，空气湿度为85%～90%。每隔3 d各个处理浇灌25 ml不同pH值模拟酸雨溶液。

1.2.2 硝普钠缓解酸雨胁迫下龙眼种子萌发试验 种子消毒后先分别用0 mmol/L(CK)、0.05 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L和1.00 mmol/L的硝普钠(SNP)溶液于黑暗中浸泡4 d，每个处理20粒种子，共3个重复。将经过SNP浸泡后的种子，播种于塑料杯的干燥河沙中，再用pH 3.5的模拟酸雨进行浇灌，然后置于恒温培养箱中培养，每隔3 d各个处理浇灌pH 3.5模拟酸雨溶液。

1.3 测定方法

每天观察种子萌发情况，播种后5 d统计种子的发芽势;播种后10 d统计种子的发芽率和发芽指数;发芽后11 d测量幼苗株高、鲜质量、生根数和根长度;发芽后20 d进行根系丙二醛含量和根系活力测定。种子萌发标准以胚根突破种皮0.5 cm视为萌发;发芽率=发芽的种子数/供试的种子总数×100%;发芽势=前5 d正常发芽的种子数/供试种子总数×100%;发芽指数(GI)=Σ Gt/Dt，Gt为在t日的发芽数，Dt为发芽天数。用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量，用TTC法进行根系活力的测定。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2003和DPS7.55软件对试验数据进行差异显著性分析，图表数据均为3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 硝普钠对酸雨胁迫下龙眼种子萌发的影响

由表1可以看出，模拟酸雨pH值为2.0～3.0时，龙眼种子的发芽势、发芽率、发芽指数均为0。模拟酸雨pH值为3.5～6.5时，随着pH值的升高，龙眼种子的发芽势、发芽率和发芽指数均呈现升高趋势。pH值为5.0时龙眼种子发芽势、发芽率和发芽指数达到最大值，发芽势和发芽指数与对照差异不显著，发芽率显著高于对照;可见pH 5.0模拟酸雨有利于龙眼种子的萌发。

在pH 3.5模拟酸雨下，硝普钠能够在一定程度上提高龙眼种子的发芽势、发芽率和发芽指数(表2)。由表2可以看出，pH 3.5模拟酸雨条件下，龙眼种子的发芽率、发芽势和发芽指数均随着硝普钠浓度的升高呈现出先上升后下降的变化趋势;硝普钠浓度为0.25 mmol/L时达到最大值，发芽率、发芽势和发芽指数分别比对照提高6.34倍、6.44倍和5.57倍;硝普钠浓度为1.00 mmol/L时龙眼种子的发芽率、发芽势和发芽指数与对照差异不显著。硝普钠浓度为0.05～0.75 mmol/L时能够缓解酸雨对龙眼种子的胁迫作用。说明低浓度硝普钠能够缓解酸雨胁迫对龙眼种子的伤害，而高浓度硝普钠的缓解作用较弱。可见，pH 3.5模拟酸雨显著抑制龙眼种子的萌发，而低浓度硝普钠能够提高龙眼种子活力，缓解酸雨胁迫对龙眼种子萌发的抑制作用，从而促进种子萌发。

表1 模拟酸雨对龙眼种子萌发的影响Table 1 Effects of simulated acid rain on seed germination of Dimocarpus longan

表2 不同浓度硝普钠对酸雨胁迫下龙眼种子萌发的影响Table 2 Effects of different concentrations of sodium nitroprusside on seed germination of Dimocarpus longan under acid rain stress

2.2 硝普钠对酸雨胁迫下龙眼幼苗生长的影响

模拟酸雨pH值为2.0～3.0时，龙眼种子没有萌发。由表3可以看出，模拟酸雨pH值为3.5～5.0时，随着pH值的升高，龙眼幼苗的株高、鲜质量、生根数和根长均增加;pH 5.0时龙眼幼苗的株高、鲜质量和根长均达到最大值，并且显著高于对照幼苗;pH 5.0时幼苗的生根数低于对照。可见，酸雨胁迫对龙眼幼苗生长的影响主要体现在根系的生长，模拟酸雨pH 5.0有利于龙眼幼苗的生长。

表3 模拟酸雨对龙眼幼苗生长的影响Table 3 Effects of simulated acid rain on growth of Dimocarpus longan seedlings

由表4可以看出，pH 3.5酸雨胁迫下，龙眼幼苗株高随着硝普钠浓度增加呈现下降趋势，硝普钠浓度为0.25 mmol/L时，龙眼幼苗株高达到最大值。龙眼幼苗的鲜质量、生根数和根长均随着硝普钠浓度增加而下降，硝普钠浓度为0.05 mmol/L和0.25 mmol/L时显著高于对照和其他处理，0.05 mmol/L和0.25 mmol/L硝普钠处理间的差异不显著，而0.75 mmol/L和1.00 mmol/L硝普钠处理与对照间的差异不显著。可见，低浓度硝普钠(0.05 mmol/L和0.25 mmol/L)能显著缓解酸雨胁迫促进龙眼幼苗根部的生长，提高幼苗的鲜质量。

表4 不同浓度硝普钠对酸雨胁迫下龙眼幼苗生长的影响Table 4 Effects of different concentrations of sodium nitroprusside on growth of Dimocarpus longan seedlings under acid rain stress

2.3 硝普钠对酸雨胁迫下龙眼幼苗根系活力的影响

根系直接影响着龙眼幼苗地上部分的生长和营养吸收状况。模拟酸雨pH值为2.0～3.5时，由于龙眼种子没有萌发，没有生成幼苗;模拟酸雨pH值为4.0～6.5时，根系活力随着模拟酸雨pH值的升高而呈现先增加后降低的变化趋势(图1)，其中pH 5.0时龙眼幼苗的根系活力达到最大值，其根系活力是对照的2.2倍。可见，弱酸条件(pH 5.0)能够提高根系活力，能促进根系发育，增加根系水分和营养物质的吸收，从而促进幼苗地上部分的生长。

根系影响幼苗吸收水分和营养物质，龙眼幼苗地上部分生长的好坏很大程度上取决于根系的活力。从图2可以看出，pH 3.5酸雨胁迫下，幼苗根系活力随着硝普钠浓度升高呈现先上升后下降的变化趋势;硝普钠浓度为0.25 mmol/L时，根系活力达到了最大值。可见，酸雨胁迫下，低浓度硝普钠能够提高龙眼幼苗根系活力，高浓度硝普钠则抑制幼苗根系活力。

图1 模拟酸雨对龙眼幼苗根系活力的影响Fig.1 Effects of simulated acid rain stress on root activity in longan seedlings

图2 酸雨胁迫下硝普钠对龙眼幼苗根系活力的影响Fig.2 Effects of sodiumn nitroprusside on root activity in longan seedlings under acid rain stress

2.4 硝普钠对酸雨胁迫下龙眼幼苗丙二醛含量的影响

模拟酸雨pH值为2.0～3.0时，种子没有萌发，没有生成幼苗;模拟酸雨pH值为3.5～6.5时龙眼幼苗根部丙二醛含量的变化见图3。由图3可以看出，模拟酸雨pH值为4.0和4.5时，龙眼幼苗根部的丙二醛含量分别比对照(pH 6.5)分别提高37.75%和36.64%，说明在酸性增加的条件下，根部中膜脂过氧化作用加强，根系的丙二醛含量增加;模拟酸雨pH值为5.0时，龙眼幼苗根部丙二醛的含量比对照降低了28.70%，说明弱酸性条件有利于降低龙眼幼苗的膜脂过氧化作用。

pH 3.5酸雨胁迫下，不同浓度硝普钠对龙眼幼苗丙二醛含量的影响见图4。由图4可以看出，龙眼幼苗的丙二醛含量随着硝普钠浓度增加呈现出先降低后升高的变化;硝普钠浓度为0.25 mmol/L时龙眼幼苗丙二醛含量降至最低值。但各处理的丙二醛含量值均较高，说明pH 3.5的酸雨胁迫对龙眼幼苗的膜脂过氧化作用较强。低浓度硝普钠(0.05 mmol/L和0.25 mmol/L)能够降低龙眼幼苗的丙二醛含量，说明低浓度硝普钠能够缓解酸雨胁迫降低龙眼幼苗的膜脂过氧化作用，从而保持膜的完整和流动性，增加龙眼种子抗酸雨的能力。

图3 模拟酸雨对龙眼幼苗叶片丙二醛含量的影响Fig.3 Effects of simulated acid rain stress on MDA contents in the leaves of longan seedlings

图4 硝普钠对酸雨胁迫下龙眼幼苗叶片丙二醛含量的影响Fig.4 Effects of sodiumn nitroprusside on MDA contents in the leaves of longan seedlings under acid rain stress

3 讨论

3.1 模拟酸雨对龙眼种子萌发和幼苗生理特性的影响

种子作为植物繁殖体，其萌发率高低、萌发速度快慢、出苗整齐与否及幼苗强弱与产量有密切关系。同时种子的萌发是植物整个生命史的关键，而生活在酸雨环境中的植物在萌发过程中的耐酸能力又是其幼苗建立的关键。本试验结果表明，不同pH值模拟酸雨对龙眼种子萌发和幼苗生长均有不同程度的影响:pH 2.0～3.0时龙眼种子不发芽，pH 3.5～5.0时龙眼种子都能正常发芽，发芽势、发芽率、发芽指数与pH呈正相关;酸性较弱时(pH 5.0)，发芽势、发芽率、发芽指数、株高、生根数、根长和根系活力较对照高，说明一定的弱酸环境对龙眼种子的前期萌发有一定促进作用。随着酸性增强(pH≤4.5)，发芽势、发芽率、发芽指数、株高、生根数、根长和根系活力均明显降低;pH 4.0时对龙眼种子萌发产生明显抑制作用。pH≤3.0时，龙眼种子已不能正常萌发，这可能是由于酸雨酸度过高，超过龙眼种子萌发的耐受极限，以及长时间酸雨胁迫所致。这也与国内外在小麦［14］、黄瓜［15］和紫花苜宿［16］上的报道结果一致。模拟酸雨对幼苗的生长量影响明显，酸雨显著降低龙眼根系活力，影响龙眼幼苗根的生长，及其对营养物质的吸收，因而抑制幼苗植株的生长，使幼苗株高和鲜质量随酸雨胁迫程度的增大而下降。

3.2 NO缓解模拟酸雨对龙眼种子萌发和幼苗生理特性的影响

硝普钠是一种常用的外源NO供体。NO作为一种信号调节分子和活性氧清除剂能调节植物对生物与非生物胁迫的适应反应，但外源NO浓度过高时对生物体有毒害作用［1-4］。本研究结果表明，低浓度硝普钠(0.05 mmol/L和0.25 mmol/L)能够缓解较高浓度酸雨(pH 3.5)对龙眼种子萌发的抑制作用，提高酸雨胁迫下龙眼种子的发芽指数和活力指数，促进下胚轴伸长和胚根的生长，增加干物质的积累。这是由于低浓度硝普钠能提高酸雨胁迫下龙眼种子中过氧化酶的活性，降低丙二醛的积累。上述过程与硝普钠缓解水分胁迫(渗透胁迫)的作用机制相似［8-11］。高浓度硝普钠(1.00 mmol/L)处理的龙眼种子在酸雨胁迫下萌发能力下降，这可能是高浓度NO与O2·-相互作用生成大量的过氧亚硝酸根阴离子，后者经质子化后形成具有强氧化性的过氧亚硝酸，破坏生物大分子的结构与功能，具有生物毒性。因此，NO对酸雨胁迫下龙眼种子萌发和幼苗生长具有“低浓度促进、高浓度抑制”的双重性。

龙眼种子对酸雨胁迫的响应过程是一个复杂的过程，其中涉及了许多的信号通路。而NO供体硝普钠对酸雨胁迫下龙眼种子萌发及生理特性的影响也不仅仅影响着根系的活力和丙二醛含量的累积，其中涉及了很多种的酶类物质。因此这些问题有待于进一步的解决。

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