鸡β－防御素－9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

许兰娇 洪智敏 司 微 刘宝生 张锦华 刘思国 黎观红＊

（1.江西农业大学动物科技学院，南昌330045；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001）

鸡 β－ 防 御 素 －9（chickenβ－defensin－9，AvBD9）是鸡天然免疫的重要组成部分，广泛分布于皮肤、消化道及呼吸道等黏膜，在鸡的免疫防御系统中发挥重要作用。AvBD9具有很强的杀灭致病细菌和真菌活性，而且AvBD9在高盐浓度（150mmol/L NaCl）条件下对许多致病菌仍具有杀菌活性［1］。天然存在的抗菌肽产量很低，无法从动植物体内大量提取。AvBD9作为一种家禽基因编码的阳离子抗菌肽，其分子质量小，易被蛋白酶降解，而且对宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli）有毒性，因而不能在大肠杆菌中直接表达，并且免疫原性较弱，单独免疫新西兰大白兔不能激起较强的免疫应答［2－4］，而以融合蛋白形式表达则可克服这些困难。国内外学者对鸡β－防御素在鸡各种组织及消化道的分布表达进行了大量研究，表明AvBD9广泛分布于鸡组织中且具有组织特异性表达特点［5－9］。然而，研究者对 AvBD9在组织中分布表达的研究仅限于在基因（mRNA）水平上研究。因此，为从蛋白质水平上鉴定AvBD9在组织中的合成和分布，AvBD9抗体的制备就显得非常必要。本研究旨在利用原核系统表达AvBD9重组蛋白制备兔源多克隆抗体，为AvBD9的检测及相关研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物、菌株及质粒

2.5kg雌性新西兰大白兔2只，购自哈尔滨兽医研究所动物实验中心。大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞由哈尔滨兽医研究所细菌室提供，原核质粒pGEX－6P－1购自美国GE公司。

1.2 主要试剂

T4DNA连接酶、EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶、异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）均购自宝生物工程（大连）有限公司；丙烯酰胺（30%）购自美国Bio－Rad公司；质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；凝胶回收试剂盒购自美国罗氏公司；BugBuster蛋白抽提试剂购自德国 Merck公司；辣根过氧化酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、N，N，N’，N’－四甲基乙二胺（TEMED）、Amp＋购自美国Sigma公司；透析袋购自北京索莱宝生物科技有限公司；脱脂乳购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂购自商业公司，均为分析纯。

1.3 重组载体的构建

1.3.1 AvBD9的合成及载体酶切

目的基因片段由上海生工生物公司合成，根据GenBank登录号（NM＿001001611）获取目的基因片段，合成AvBD9的成熟肽DNA全长编码序列。根据表达载体pGEX－6 P－1的结构，在目的序列两端引入酶切位点EcoRⅠ及SalⅠ。应用EcoRⅠ和SalⅠ对合成的AvBD9成熟肽基因片段和pGEX－6 P－1 酶 切；酶 切 体 系 （50μL）：载 体pGEX－6 P－1 10μL，EcoRⅠ1μL，SalⅠ1μL，1×Tango buffer 5μL，dd H2O 33μL。按Promega试剂盒操作说明分别对酶切产物进行胶回收和定量，回收产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据目的片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，进行连接反应。连接反应体系（10μL）：T4ligase 1.0μL，T4ligase buffer 1.0μL，双酶切的pGEX－6 P－1 0.5μL，双酶切的 AvBD9 4.5μL，dd H2O 3.0μL，22℃连接2h。

1.3.2 重组载体的鉴定

将 pGEX－6 P－1－AvBD9 加 入 到100μL 大 肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，混匀内容物，无抗性LB液体培养基37℃复苏细菌，将细菌涂于添加Amp＋抗性的LB培养板中，37℃恒温培养12～16h出现菌落，挑取菌落于LB液体培养基中培养12h。根据Omega公司质粒提取试剂盒步骤提取质粒，双酶切鉴定，50%甘油保存阳性菌种。

1.4 融合蛋白的诱导表达及纯化

接种阳性克隆菌于LB液体培养基中，摇床培养过夜，按1∶100比例接入LB液体培养基中。37℃恒温摇床（220r/min）培养至对数生长期（OD600nm值为0.6～1.0），加入IPTG诱导融合蛋白 表 达4h。IPTG 浓 度 设5个 梯 度：0.125、0.250、0.500、0.750、1.000mmol/L，温 度 设 2 个梯度：25和37℃。诱导表达后8 000r/min离心10min，用pH 8.0的Tris－HCl清洗菌体后离心，菌体沉淀中加入1/10菌体体积的磷酸盐缓冲液（PBS）及等体积的2×十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶上 样 缓 冲 液，煮 沸 10min，12 000r/min离 心15min，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）鉴定融合蛋白的表达。同时将诱导的菌 体 离 心，沉 淀 经 50mmol/L Tris－HCl（pH 8.5～9.0）、2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、100 mmol/L NaCl、0.5%Triton X－100 混 合 液 重 悬。冰上20Hz超声裂解细菌细胞，工作时间3s，间歇3s，总超声时间为20min。分别取上清和沉淀进行SDS－PAGE电泳。电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇－冰乙酸脱色液脱色观察结果，证实pGEXAvBD9融合蛋白以包涵体形式存在。

按照Merck公司的BugBuster蛋白抽提试剂说明书进行蛋白的纯化，去除可溶蛋白，得到纯化后的包涵体蛋白。将纯化后的包涵体蛋白经SDSPAGE电泳后，切取目的条带即融合蛋白。融合蛋白 电 洗 脱 纯 化 按 Laemmli［10］的 方 法 进 行，SDSPAGE电泳检验电洗脱蛋白纯度；以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，采用Bradford法测定纯化蛋白浓度。

1.5 AvBD9多克隆抗体的制备

用切胶纯化的谷胱甘肽转移酶－AvBD9（GST－AvBD9）融合蛋白常规免疫新西兰大白兔，每次免疫剂量500μg，溶于PBS缓冲液中。首次与弗氏完全佐剂等体积混合，4℃磁力搅拌至蛋白质呈乳状，对新西兰大白兔颈部及皮下多点注射；2周后以同样的抗原剂量与弗氏不完全佐剂乳化后增强免疫；此后每隔10d免疫1次，共4次；最后1次以不含佐剂的抗原从耳静脉免疫，7d后常规心脏取血，制备血清。

1.6 抗体效价的测定

间接酶联免疫分析（ELISA）方法检测抗体效价参照文献［11］所述的方法，并进行适当修改。GST－AvBD9融合蛋白用包被液稀释后包被酶标板，待测孔分别加入1∶400稀释的兔抗血清，用免疫GST－AvBD9蛋白前的兔血清作为阴性对照。二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶40 000稀释），底物显色剂为四甲基联苯胺（TMB），用酶标仪测定波长490nm处的吸光度值。

1.7 抗体特异性的检测

取纯化后的融合蛋白GST－AvBD9及空载体pGEX－6P－1表 达 蛋 白 样 品 进 行 SDS－PAGE 电 泳后，用半干法电转移至硝酸纤维素（NC）膜上，5%脱脂奶粉封闭后，以本试验制备的兔抗血清（1∶100稀释）为一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶16 000稀释）为二抗进行反应。二氨基联苯胺（DAB）避光显色10～15min，双蒸水洗终止反应。

2 结 果

2.1 重组质粒的鉴定

EcoRⅠ、SalⅠ酶切后的载体pGEX－6P－1和目的基因AvBD9经连接重组后获得的重组质粒pGEX6 P－AvBD9片段长度为5 100bp左右，基因AvBD9片段长度约200bp，如图1。

图1 重组质粒pGEX6P－AvBD9酶切鉴定Fig.1 Identification of pGEX6P－AvBD9recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

2.2 融合蛋白的纯化

重组原核表达质粒pGEX－6P－AvBD9转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，经IPTG诱导后菌体超声破碎，取上清和沉淀分别进行SDS－PAGE电泳，上清中几乎无融合蛋白GST－AvBD9表达，证明融合蛋白GST－AvBD9以包涵体形式在宿主菌内高效表达。谷胱甘肽转移酶（GST）标签蛋白分子质量约为26ku，融合后的蛋白分子质量约为34ku。试验中还尝试17℃低温，慢速160r/min过夜诱导融合蛋白在大肠杆菌中表达，结果融合的目的蛋白仍以包涵体形式存在。试验中IPTG设置5个浓度梯度，温度则分别设25、37℃2个梯度，经SDS－PGFE电泳分析鉴定，从图2可以看出，IPTG诱导浓度及温度对融合蛋白GSTAvBD9表达量影响不大；GST标签蛋白分子质量约为26ku，融合后的蛋白分子质量约为34ku。试验中还尝试17℃低温，慢速160r/min过夜诱导融合蛋白在大肠杆菌种表达，结果融合的目的蛋白仍以包涵体形式存在。

图2 重组质粒pGEX6P－AvBD9融合表达蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 Analysis of GST－AvBD9recombinant plasmid fusion protein by SDS－PAGE

如图3所示，经SDS－PAGE检测，纯化后的目的融合蛋白在34ku处出现单一的目的蛋白条带，与预期蛋白分子量相当。在经测定，纯化后得到的融合蛋白浓度为1.8mg/mL。

2.3 抗体效价测定结果

免疫融合蛋白GST－AvBD9前的新西兰大白兔血清为阴性对照，加强免疫后的新西兰大白兔心脏采血，并立即将血液放入37℃恒温箱1h，然后取出放入4℃冰箱2h，收集抗血清，－20℃保存备用。经间接ELISA测定，选出最适包被浓度为5μg/mL，抗纯化的融合蛋白GST－AvBD9的抗体滴度为38 400倍。

2.4 抗体免疫原性鉴定结果

对纯化的融合蛋白GST－AvBD9及空载体pGEX－6P－1表达蛋白样品进行SDS－PAGE电泳，将凝胶上的目的蛋白转移到NC膜中，并对NC膜进行封闭、一抗、二抗孵育，然后用DAB显色，结果在34ku处出现明显的特异性杂交条带（图4），表明本试验制备的多克隆抗体具有免疫反应性和蛋白特异性，同时也表明融合蛋白在大肠杆菌中的表达获得了成功。

图3 纯化GST－AvBD9及GST标签蛋白的SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis of SDS－PAGE of purified GST－AvBD9and tag protein

图4 GST－AvBD9融合蛋白的蛋白质免疫印迹分析Fig.4 Western bolt analysis of GST－AvBD9fusion protein

3 讨 论

防御素天然产量低，合成或从机体中提取步骤复杂且产量低。目前从原核表达、真核表达及转基因植物表达等方面对防御素进行研究已成为热点。然而防御素多为小分子的碱性多肽，易受到蛋白酶的影响，而且表达产物往往对宿主细胞有毒性。因此，抗菌肽的外源表达存在很大的困难，目前主要是以融合蛋白的形式进行表达。

pGEX载体是原核表达中常用的载体，pGEX都带有tac启动子，实现了化学诱导的高水平表达。本试验选择pGEX－6P－1载体，将AvBD9与GST融合表达，融合表达可降低抗菌肽对宿主菌的毒性，同时也保护目的蛋白不被蛋白酶水解。本研究中的融合蛋白在宿主细胞中大量表达，经SDS－PAGE电泳分析后，发现融合蛋白以包涵体形式存在。为了获取包涵体蛋白，首先要进行细菌细胞破碎，菌体细胞破碎的方法有很多，较常用的有超声波破碎、化学试剂及酶等的处理。细胞破碎不完全会影响包涵体的提取量，破碎过度会使包涵体蛋白降解［12］。本试验采用Merck公司的BugBuster蛋白抽提试剂进行包涵体蛋白的纯化，加入裂解液孵育后菌体基本完全破碎，且悬液不黏稠，可获得纯度较高的包涵体蛋白。本试验在大肠杆菌生长的指数期即OD600nm＝0.6时，进行诱导表达。IPTG的诱导浓度和诱导温度上分别设有梯度，经SDS－PAGE电泳分析，不同浓度的IPTG诱导后，融合蛋白GST－AvBD9的表达量无明显变化；且2个不同的诱导温度作用下，目的蛋白表达量亦无明显变化，均以包涵体形式存在。本试验还尝试低温17℃，低转速120r/min过夜诱导蛋白表达，经SDS－PAGE电泳分析，融合蛋白仍以包涵体形式存在。试验中还尝试利用构建PET－32a－AvBD9载 体，诱 导 表 达 HIS－AvBD9 融合蛋白，但经SDS－PAGE电泳检测，诱导后宿主菌中不表达该融合蛋白。

AvBD9本身对大肠杆菌具有毒性，以包涵体形式在宿主菌内表达是其最佳表达方式。但是包涵体蛋白的溶解及复性过程复杂，而未能充分溶解的带GST标签蛋白不易与柱子结合，且回收率低。通过PreScission蛋白酶切除标签蛋白，过柱洗脱以获得目的蛋白，但试验中酶切及过柱效果都不理想。因此采取切胶经电洗脱获得融合蛋白，该融合蛋白仍具有免疫原性，用于免疫新西兰大白兔获得抗GST－AvBD蛋白多克隆抗体。经ELISA检测表明抗GST－AvBD9的抗体滴度高达1∶38 400；利用蛋白质免疫印迹（Western blot）方法检测表明，所获得的多克隆抗体能与GSTAvBD9融合蛋白特异性结合。因此本试验所获得的多克隆抗体可用于检测AvBD9蛋白表达等相关试验，为进一步研究AvBD9生物学功能以及从蛋白质水平检测AvBD9基因表达奠定了良好基础。

4 结 论

本试验利用基因工程的方法，构建了原核表达载体pGEX6 P－AvBD9，在宿主菌中以包涵体蛋白形式进行表达，通过切胶纯化获得GST－AvBD9融合蛋白，以表达GST－AvBD9融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，经ELISA及 Western－blot方法检测，获得了具有较高抗体滴度及特异性良好的GST－AvBD9融合蛋白多克隆抗血清。

［1］ VAN DIJK A，VELDHUIZEN E J，KALKHOVE S I，et al.The beta－defensin gallinacin－6is expressed in the chicken digestive tract and has antimicrobial activity against food－borne pathogens［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2007，51（3）：912－922.

［2］ HARA S，YAMAKAWA M.Production in Esherichia coli of moricin，a novel type antibacterial peptide from the silk worm，Bombyx mori［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1996，220（3）：664－669.

［3］ KIM J，PARK J M，LEE B J.High－level expression and efficient purification of the antimicrobial peptide gaegurin 4in E.coli［J］.Protein and Peptide Letters，1997，4（6）：391－396.

［4］ PIERCE J C，MALOY W L，SALVADOR L，et al.Recombinant expression of the antimicrobial peptide polyphemusin and its activity against the protozoan oyster pathogen Perkinsus marinus［J］.Molecular Marine Biology and Biotechnology，1997，6（3）：248－259.

［5］ LYNN D J，HIGGS R，GAINES S，et al.Bioinformatic discovery and initial characterization of nine novel antimicrobial peptides genes in the chicken［J］.Immunogenetics，2004，56（3）：170－177.

［6］ XIAO Y，HUGHES A L，ANDO J，et al.A genomewide screen identifies a singleβ－defensin gene cluster in the chicken：implications for the origin and evolution of mammalian defensins［J］.BMC Genomics，2004，5（3）：56－66.

［7］ VAN DIJK A，VELDHUIZEN E A，HAAGSMAN H P.Avian defensins［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2008，124（1/2）：1－18.

［8］ DERACHE C，ESNAULT E，BONSERGENT C，et al.Differential modulation ofβ－defensin gene expression by Salmonella Enteritidis in intestinal epithelial cells from resistant and susceptible chicken inbred lines［J］.Developmental and Comparative Immunology，2009，33（9）：959－966.

［9］ EBERS K L，ZHANG C Y，ZHANG M Z，et al.Transcriptional profiling avian beta－defensins in chicken oviduct epithelial cells before and after infection with Salmonella enterica serovar enteritidis［J］.BMC Microbiology，2009（9）：153－162.

［10］ LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，247：680－685.

［11］ 萨姆布鲁克J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南［M］.黄培堂，译.3版.北京：科学出版社，2002：1256－1259.

［12］ 石建州.家禽β－防御素基因的克隆、原核表达及活性鉴定［D］.硕士学位论文.郑州：河南农业大学，2007：58－63.