SHP－2和转化生长因子β在中老年患者宫颈鳞癌组织中的表达

宋 利

(沈阳医学院奉天医院妇产科，辽宁 沈阳 110024)

肿瘤的发生与信号转导密切相关〔1〕。蛋白酪氨酸磷酸酶是一种经典的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，在信号转导过程中起关键作用，并在许多生理调节过程中也具有重要作用，其主要通过调节细胞内酪氨酸的磷酸化水平来调控细胞的生长、增殖、分化、代谢、迁移、适应、防御、基因转录和凋亡等〔2〕。目前有证据表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B与肿瘤具有相关性〔3〕。SHP-2是一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，其介导的信号转导异常与多种疾病包括肿瘤的发生和发展密切相关〔4〕。大量研究提示，转化生长因子β(TGF-β)可能参与了宫颈癌的发生与发展〔5～7〕。而 SHP-1/2 能够调节 TGF-β 介导的信号分子(如src kinases)的活性〔8，9〕，基于此，课题组假设 SHP-2 在宫颈癌的形成和发展中发挥着重要的作用。本实验采用分子生物学技术从蛋白和基因水平观察正常宫颈、宫颈上皮内肿瘤(CIN)和宫颈鳞癌组织中SHP-2和TGF-β的表达。

1 资料与方法

1.1 标本来源 纳入2009年7月至2012年4月在沈阳医学院奉天医院妇产科住院治疗的患者。其中宫颈鳞癌患者120例，年龄45～72岁，平均(43±5)岁;CIN患者80例，年龄42～72岁，平均(45±4)岁;宫颈正常患者30例，年龄43～67岁，平均(42±3)岁。所有患者在取材前均未经任何治疗，均经病理诊断证实，排除宫颈腺癌患者。所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色检测宫颈组织SHP-2和TGF-β的表达取宫颈组织，10%甲醛固定后，脱水，浸蜡，包埋，行4μm厚连续切片，切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后微波修复抗原;3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶;在兔抗SHP-2和TGF-β多克隆抗体(1∶500;Santa Cruz公司)中4℃孵育过夜;生物素标记的羊抗兔IgG中孵育2 h(37℃);DAB显色，显微镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤终止反应，苏木精复染，自来水冲洗，返蓝;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。用PBS代替一抗作为阴性对照。每例标本随机取3个视野(100倍)，应用 Image-Pro Plus图像分析软件测量 SHP-2和TGF-β的IOD，取平均值。

1.2.2 实时RT-PCR检测宫颈癌组织SHP-2 mRNA的表达按Trizol试剂说明提取各组宫颈标本组织细胞总RNA，并检测RNA完整性和纯度，利用cDNA反转录试剂盒将RNA反转录成 cDNA。根据 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)的人SHP-2 mRNA序列，以primer5.0设计其上、下游引物序列。SHP2:上游:5'-GGA GGG CGG GAG GAA CAT GAC ATC-3'，下游:5'-GGG AGA GGG TGA AAG TCC ACA TCT AT-3';β-actin:上游 5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'，下游:5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3'。利用特异引物和PCR扩增试剂盒分别合成SHP-2和β-actin基因。PCR反应条件:94℃，预变性 5 min。94℃变性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸1 min，共40个循环。72℃延伸10 min。应用 Rotor-Gene 3000荧光实时定量PCR仪(香港基因有限公司)的Comparative Delta-delta Ct法对获得的荧光曲线结果进行分析，以同一样品目的基因扩增产物和内参β-actin的扩增产物的比值确定目的基因的表达水平。

1.2.3 Western印迹法检测宫颈癌组织SHP-2蛋白的表达分别取各组宫颈标本组织，用细胞裂解液提取蛋白，Bradford方法测蛋白浓度;调节蛋白浓度一致，取等量蛋白样品，行SDSPAGE电泳分离蛋白，然后用半干式电转的方法将蛋白质转移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白37℃封闭2 h，1∶200的兔抗SHP-2单克隆抗体中4℃孵育过夜;生物素标记的羊抗兔IgG中37℃孵育2 h，DAB显色，见有清晰条带出现即用双蒸水终止显色。所得图像用扫描仪扫描，应用北京航天航空大学CM-2000B型生物医学图像分析系统测量条带的吸光度值，将目的蛋白吸光度值与GAPDH的比值作为结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行分析，结果用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织TGF-β的表达 免疫组化染色结果显示在正常宫颈组织仅有个别标本中可见TGF-β的表达，显示出弱的棕黄色，主要集中在胞质;CIN标本中TGF-β阳性表达的数量较正常宫颈标本多，但染色依旧较弱;宫颈鳞癌组织TGF-β阳性标本数目明显增多，染色也相对较深，见图1。应用Image-Pro Plus图像分析软件对所有标本TGF-β的IOD值进行测量，结果显示在正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织，TGF-β的表达分别为(0.934 ±0.652)，(2.673 ±0.638)，(3.784±0.538)，三者间两两比较差异显著(P＜0.05)。

图1 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织TGF-β的表达(免疫组化染色，×100)

2.2 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织SHP-2的分布与表达免疫组化染色结果显示SHP-2的表达以胞质染色阳性为主，也有少许胞核染色阳性，见图2。与正常宫颈组织比较，CIN及宫颈鳞癌组织中SHP-2的表达明显增高(P＜0.05)，且宫颈鳞癌组织中SHP-2的表达明显高于CIN(P＜0.05)，见表1。

2.3 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织SHP-2 mRNA的表达宫颈鳞癌组织中SHP-2 mRNA表达最高，其次是CIN，在正常宫颈中表达最低，见表1。

图2 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织SHP-2的表达(免疫组化染色，×100)

表1 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织SHP-2蛋白及mRNA的表达(x±s)

2.4 正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织SHP-2蛋白的表达Western印迹可见，在正常宫颈组织中几乎看不到SHP-2蛋白的表达，而在宫颈鳞癌组织中SHP-2蛋白条带较深，表达最多，CIN组织中的SHP-2蛋白条带介于正常宫颈和宫颈鳞癌组织之间，见图3，三者间两两比较差异显著(P＜0.05)，见表1。

图3 Western印迹检测正常宫颈、CIN及宫颈鳞癌组织SHP-2的表达

3 讨论

SHP-2是一种由PTPNII基因编码的广泛分布在胞浆中的蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2个SH结构域和1个催化功能结构域。其作为细胞因子、生长因子及其他胞外刺激因素的下游信号分子参与了细胞的增殖、分化、死亡等过程〔10〕。同时一些研究发现，其与一些癌症密切相关。然而赵硕〔11〕对癌症组织中SHP-2 mRNA水平进行检测并未发现SHP-2在癌症组织及正常组织中表达明显差异，发现了与其同源性较高的pseudo基因的差异表达。但也有研究显示〔12〕，在人体几种主要器官，包括肺癌、胃癌、卵巢癌、直肠癌、乳腺癌、结肠癌等的正常和癌变组织中，SHP-2在蛋白和mRNA水平上均产生了差异表达。且研究发现其在一些恶性肿瘤中高度活化，可能与癌症的发生离不开信号转导改变有关。而SHP-2在从细胞表面到细胞核的信号传导通路中扮演重要角色，主要包括JAK-STAT途径、Ras-MAPK途径及PI3K途径。而且SHP-2通过对细胞内磷酸化的酪氨酸残基去磷酸化调节细胞的增殖与分化，而异常的增殖和分化正是肿瘤细胞的特征之一。

本研究发现SHP-2在宫颈鳞癌组织中表达最高，CIN组织次之，正常宫颈组织中表达最低，与孟斐〔13〕测得的SHP-2在宫颈癌患者血清中SHP-2的表达升高相一致。提示SHP-2参与了宫颈癌的发生，且与癌症的分型密切相关。SHP-2的过度表达参与了宫颈癌的发生。

TGF-β是功能复杂的细胞因子，具有调节细胞生长、分化、血管形成、细胞凋亡等多种功能，还参与细胞外基质的重建、间质细胞的产生和机体抗肿瘤免疫等，因此其与很多肿瘤的发生、发展有密切关系〔14，15〕。本实验发现 TGF-β1在宫颈鳞癌组织中表达最高，CIN组织次之，正常宫颈中表达最低，验证了TGF-β在宫颈癌形成中的作用。

总之，本实验从蛋白和基因水平证实了SHP-2在宫颈鳞癌组织高表达，可能参与了宫颈癌的形成及分型，并发现了SHP-2和TGF-β在宫颈癌组织中表达具有一致性，但具体的作用机制及信号调节通路还有待进一步研究。

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