襄阳孔明菜卤水中耐盐污染菌的分离与鉴定

徐婷，张成杰，张桂敏

（湖北大学生命科学学院，湖北 武汉430062）

0 引言

蔬菜腌制，是一种有着悠久历史的蔬菜加工贮藏方法.它是利用高浓度的盐液与微生物发酵来保藏蔬菜，并通过腌制产生不同的风味.由于腌制方法与所需的设备皆比较简单易行，所需的材料也可就地获取，因此在不同的地区就形成了许多风格及味道独特的腌制类食品，如重庆的涪陵榨菜、四川的冬菜，襄阳的孔明菜等等.

襄阳孔明菜，在襄阳俗称“襄阳大头菜”、“诸葛亮菜”，是以芥菜为原料加工而成.芥菜属十字花科，肉质坚实，白色，质地紧密，水分少，纤维多，形状为锥型，有强烈的芥辣味，不宜生吃，一般经选料、初晒、拌料、复晒、加料、密封和腌制等工序加工而成为现在驰名中外的襄阳孔明菜［1］.有记载，襄阳孔明菜乃是1800年前诸葛亮妙手偶得，它含有丰富的氨基酸、维生素、纤维素及铁、锌、钙、磷等多种人体所需的微量元素，入口脆嫩味美，生津开胃，酱香浓郁，并具有下气消食、利尿除湿、解毒消肿之功效［2］.目前，襄阳孔明菜已经由传统的自己播种自行腌制、家庭作坊为主发展到现在的“三腌、五卤、六晒”的工厂化运作，逐渐形成了“孔明”、“隆中”等一批颇具三国文化氛围的产品品牌，成为远近驰名的地方传统产品.然而，孔明菜的腌制周期很长，在工厂化露天腌制中，若有雨水等污水进入腌缸，在春夏秋则会产生白色的菌膜，从而导致大头菜软化，影响口感.

本研究从襄阳孔明菜卤水污染物中分离污染菌并进行鉴定，旨在对防控该污染菌、稳定工厂化生产工艺奠定基础.

1 材料及方法

1.1 样品来源 采样于襄阳市某孔明菜生产厂卤水表面的白色污染物，见图1，样品采回后放置4℃冰箱保存.

1.2 培养基 YPD培养基［3］（g／L）：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20，pH 6.0.

1.3 菌种的分离筛选 将白色污染物分别划线到含氯化钠0%，5%，10%，15%，20%（质量浓度，下同）的YPD固体培养基上，分别放入28℃和37℃培养箱中培养2～3d，挑取单菌落多次划线纯化，获得纯种.

图1 襄阳孔明菜腌制卤水和表面白色污染物

1.4 菌种的鉴定

1.4.1 菌落的培养特征和显微特征 划线接种于含5%NaCl的YPD平板培养基上，28℃培养3d，观察单菌落的形状、大小、透明度、颜色、边缘和表面等特征.挑取适量细胞制作水浸片，置于普通光学显微镜的高倍镜下观察细胞形态.

1.4.2 分离菌的最适生长盐度测定 将分离菌接种于含5%NaCl的YPD液体培养基中作为种子，再分别转接同样量的菌到含有0%，5%，10%，15%，20%NaCl的YPD液体培养基中，每个盐浓度设3个重复，28℃、200r／min培养3d，每隔12h观察摇瓶培养基变化，3d后每个盐浓度呈现明显差别，测定OD600.

1.4.3 分离菌的最适生长pH测定 将分离菌接种于含5%NaCl的YPD液体培养基中作为种子，再分别转接同样量的菌到pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，含有5%NaCl的 YPD液体培养基中，每个pH 设3个重复，28℃、200r／min培养3d，每隔12h观察摇瓶培养基变化，3d后每个pH呈现明显差别，测定OD600.

1.4.4 分离菌的最适生长温度测定 将分离菌接种于含5%NaCl的YPD液体培养基中作为种子，再分别转接同样量的菌到含有5%NaCl的YPD液体培养基中，分别放入18℃，23℃，28℃，37℃，200 r／min培养3d，每个温度设3个重复，每隔12h观察摇瓶培养基变化，3d后每个温度呈现明显差别，测定OD600.

1.4.5 分离菌的分子鉴定 采用硅胶破碎法［4］抽提所分离菌株的染色体DNA，应用18SrDNA引物［5］：正向引物 NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和反向引物 NS8（3′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-5′）进行PCR扩增.PCR反应体系（50μL）：模板1μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，dNTP 5μL，10倍Taq 缓冲液5.0μL，Taq酶0.5μL，补加超纯水至50μL.扩增程序为94℃预变性5min；然后94℃变性35s，60℃退火1min，72℃延伸1min 15s，进行30个循环；最后于72℃延伸4min.

2 结果与讨论

2.1 分离菌的培养特征和形态特征 经过3d的28℃培养后，分离到一株单菌落呈圆形、乳白色，不透明，直径0.1～0.2cm的菌株，该菌株表面湿润、粘稠，易挑起（图2A）.挑取该菌在光学显微镜下观察，其细胞呈现酵母形态，有明显的出芽状态（图2B）.而且该细胞细胞壁很厚，母细胞外壁完全、不破裂；母细胞和芽细胞的内、外层胞壁相互连续［6］.

2.2 分离菌的最适生长盐度测定 因为在孔明菜卤水中含有大量的盐，因此，我们推测，该菌的生长应该需要较高浓度的盐，因此对该菌的最适生长NaCl含量进行了研究.结果显示，该菌在不含NaCl的培养基中也能生长，最适生长NaCl质量浓度为5%；随着NaCl含量的升高，该微生物的生长受到抑制，当NaCl质量浓度高于15%时，该微生物的生长基本停止（图3）.

图2 分离菌在YPD培养基上培养特征和显微特征

图3 分离菌的最适生长盐度

2.3 分离菌的最适生长温度和pH测定 该微生物在18℃时基本不生长，随着温度的升高，逐渐开始生长，当温度为28℃时达到该微生物的最适生长温度，随着温度继续升高，该微生物逐渐停止生长（图4A）.该微生物可以在pH值5.5～6.5之间生长，最适生长pH值为6.0（图4B）.

图4 分离菌的最适生长温度和pH测试

2.4 分离菌的分子鉴定

2.4.1 分离菌18SrDNA的PCR扩增 采用硅胶破碎法提取分离菌株染色体DNA，以该染色体DNA为模板，利用真菌18SrDNA通用引物进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约1.7kb左右的条带（图5），和预计大小1 699bp一致［7］.

2.4.2 分离菌18SrDNA的序列分析与系统进化树的构建 将所扩增的DNA片段进行胶内回收，送中圣泰克生物科技有限公司进行测序.测序结果进行 BLAST［8］比对，比对结果显示，该菌的18SrDNA序列和ZygosaccharomycesrouxiiDoNor8，IFO0510，M2［9］的18SrDNA 序列一致性达到100%，初步认定分离的污染酵母是Zygosaccharomycesrouxii.再根据clustalX和MEGA4.1建构的系统进化树（图6）进行分析，该菌与Z.rouxii在同一分支上，并与酿酒酵母有一定的进化距离，同时结合已有的关于鲁氏酵母的形态特征的报道［10］进行分析，本研究分离的酵母的培养特征、显微形态特征和报道的一致，因此，认定该酵母是Zygosaccharomycesrouxii.

图5 所分离污染菌18SrDNA的PCR扩增效果图

图6 分离菌的系统进化比对结果

3 讨论

根据已有的报道可知，鲁氏酵母（Zygosaccharomycesrouxii）是常见的耐盐性的半子囊菌酵母［11］，它既是主要传统发酵食品的生产菌，例如在酱类食品中对豆酱风味起着重要作用的耐盐性酵母［12-13］；同时，又是某些低水分活度食品及原料的腐败菌.而我们从襄樊孔明菜生产工艺中的污染菌膜中分离到这种耐盐的鲁氏酵母，经鉴定属于Zygosaccharomycesrouxii.该菌在襄阳大头菜的生产中并不会造成大头菜的变质，但是会造成大头菜的软化，影响口感.从该菌的生长习性来看，该菌因为生长盐度要求不高，因此在有雨水污染时，卤水表面盐度降低，加上春夏秋适宜的生长温度，就会在卤水表面生长，形成一层菌膜，导致大头菜的软化.

根据该菌的生长习性，可以在环境温度高于18℃时，适当提高腌制卤水的生长盐浓度，降低该菌的污染.但是该方法不适于生产低盐的孔明菜，因此在低盐孔明菜的生产中，可以考虑改变卤水成为碱性环境以抑制其生长，但是碱性环境是否会引起孔明菜的软化，尚需进一步研究.因此在未来的研究中，我们将分析不同碱和不同碱浓度对该菌的生长影响和对孔明菜口感的影响.同时，从该菌的系统进化比对结果看，该菌与酿酒酵母具有一定的进化距离，在未来的研究中，我们还将进一步从生理生化方面研究鲁氏酵母与酿酒酵母的内在联系与区别.

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