Flavopiridol联合Bortezomib对多发性骨髓瘤的细胞增殖抑制作用

张 伟，董 理

（1.长春市中心医院，吉林 长春 130051；2.中国医科大学附属第四医院）

Flavopiridol联合Bortezomib对多发性骨髓瘤的细胞增殖抑制作用

张 伟1，董 理2

（1.长春市中心医院，吉林 长春 130051；2.中国医科大学附属第四医院）

目的 探讨细胞蛋白激酶抑制剂Flavopiridol及蛋白酶抑制剂Bortezomib在体内抑制多发性骨髓瘤细胞U266的细胞增殖作用及其机制。方法以不同浓度的Flavopiridol及Bortezomib分别、联合作用于U266细胞，用MTT法检测细胞增殖抑制作用。采用western blot法检测Bcl-2及Mcl-1表达变化；结果 ①Flavopiridol比Bortezomib对U266细胞增殖抑制作用更强，IC50值分别为52.5nM，25nM。②与单独用药相比，Flavopiridol联合Bortezomib作用于U266细胞，IC50值有明显的下降为17.5nM。③Flavopiridol及Bortezomib给药前后，Bcl-2蛋白表达无变化，而Mcl-1蛋白表达明显下降。结论Flavopiridol联合Bortezomib用药能在体内明显抑制多发性骨髓瘤细胞U266的生长，其机制主要是通过诱导细胞凋亡来抑制增殖。

多发性骨髓瘤；细胞蛋白激酶抑制剂Flavopiridol；蛋白酶体抑制剂Bortezomib；联合用药

（ChinJLabDiagn，2013，17：0817）

多发性骨髓瘤 （multiple myeloma，MM ）是浆细胞克隆性异常增生的血液系统恶性肿瘤［1］。其临床特点是进行性的骨质破坏，骨痛、高钙血症、病理性骨折、弥漫性骨质疏松等［2］。研究表明复发病例再次化疗组与对照组治疗成绩差异无统计学意义，这与耐药性有关，可严重影响患者的生活质量和预后［1］。

近年来，应用新的靶向药物，其中小分子细胞周期蛋白激酶抑制剂Flavopiridol［3］，及蛋白酶体抑制剂Bortezomib（硼替佐米）［4］具有着良好疗效。本文初步探讨Flavopiridol及Bortezomib联合治疗对多发性骨髓瘤细胞的细胞增殖抑制作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Flavopiridol由美国Aventis公司提供，溶于二甲基亚砜（DMSO）中，浓度10mmol／L。硼替佐米（bortezomib）由本院提供，用生理盐水稀释至50 nM储存。DMEM 培养液，胎牛血清，噻唑蓝（MTT）。Bcl-2、Mcl-1 抗 体 （Sigma公 司），b-actin抗体及辣根过氧化酶（HRP）标记的抗鼠、抗兔二抗（Santa Cmz公司）。

1.2 细胞增殖抑制实验

将U266细胞浓度调整为3×104个／ml，接种于96孔板，每孔100μl。培养24h后，实验组分别加入不同浓度的（5、10、25、50、75、150、300nM）Flavopiridol及（0.01、0.1、1、10、25、50、100nM）bortezomib，对照组加入同等稀释度的DMSO。每组设3个复孔，继续培养，24h换药，至48h终止培养，每孔加入 MTT（5g／L）20μl，继续培养4h后离心，弃上清。加DMSO，200μl，避光振15min，在全自动酶标仪上测定570nmOD值，绘细胞增殖曲线、计算细胞生长抑制率及药物的IC50值。

1.3 蛋白印迹（western blot）检测

收集正常培养的细胞和经过bortezomib、Flavopiridol及联合处理48h的细胞，裂解液裂解细胞后行聚丙烯酰胺凝胶电泳。每孔加样20μg，转移至PVDF膜上。用含体积5%脱脂奶粉的TBST（质量分数0.3%Tris，质量分数0.8%NaCl，质量分数0.02%KCl，体积分数0.1%Tween-20，pH＝7.4）封闭1h，加一抗（按说明书稀释）4℃过夜（或室温1h，视具体抗体而定）。TBST洗涤3次，每次8 min，二抗（辣根过氧化物酶标记，1∶3 000稀释）室温孵育1h。TBST洗涤3次，后显色。

1.4 统计学方法

实验数据以均值±标准差表示。多组间数据的比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的Bortezomib及Flavopiridol分别对MM细胞增殖活力的影响

将不同浓度的 Bortezomib （0.01、0.1、1、10、25、50、100nM）及 Flavopiridol（5、10、25、50、75、150、300nM）分别处理在96孔板中培养的U266细胞，48h后通过MTT法检测细胞的增殖活力，发现Flavopiridol比Bortezomib对细胞的生殖抑制性更强。IC50值分别为52.5nM，25nM。

2.2 不同浓度的Bortezomib联合Flavopiridol对MM细胞增殖的影响

Bortezomib联合Flavopiridol处理的U266细胞，以2：5浓度比在96孔板中培养，48h后通过MTT法检测细胞的增殖活力，结果显示：Bortezomib联合Flavopiridol对U266细胞的IC50值为17.5nM（图2）。三组 MTT相对IC50值比较，发现联合用药比单独用药的IC50值有明显的下降（图3）。

2.3 Flavopiridol对经Bortezomib治疗的U266细胞的 Mcl-1、Bcl-2的蛋白表达水平的影响

图1 A图为Bortezomib对U266细胞的生殖抑制作用MTT图，IC50为25nM。B图为Flavopiridol对U266细胞的生殖抑制作用MTT图，IC50为52.5nM

图2 为Bortezomib联合Flavopiridol对U266细胞的IC50值为17.5nM

图3 为三组MTT实验的IC50的相对值

Bcl-2在给药前后均为阳性，且表达无明显不同；而Mcl-1给药前后也均为阳性，但其表达水平随药物的联合应用而下降。该实验重复3次，均取得近似结果，其中在β-actin表达一致的情况下，Bcl-2蛋白表达无变化，而Mcl-1蛋白表达明显下降（见图4）。

3 讨论

我们采用 MTT法，观察Bortezomib及Flavopiridol对U266细胞增殖的作用。结果显示Bortezomib联合Flavopiridol作用于MM细胞U266时，可更好的抑制其细胞的增殖，且浓度越高、时间越长，抑制作用越强。根据文献显示［6，8］：经过Flavopiridol高浓度给药的细胞增殖抑制主要以细胞凋亡为主。

图4 为Flavopiridol（FV）及Bortezomib（BT）单独或联合给药（BT＋FV），Bcl-2和 Mcl-1的蛋白表达状态

Flavopiridol不仅在单独给药时具有肿瘤细胞增殖抑制作用［9］，与其他药物如Bortezomib联合应用也能产生强大的协同抑瘤效应［7］。进一步探索Bortezomib联合Flavopiridol诱导MM细胞凋亡的分子机制及其与其他多种因子的关系，为MM联合治疗提供新思路。

Bcl-2为膜蛋白，是细胞凋亡激活路径中的主要调控基因。通过抑制肿瘤细胞凋亡，可延长肿瘤细胞生存时间，并对不同刺激诱导的凋亡有阻抑效应［10］。有 研 究 提 示，Bcl-2 可 参 与 Bortezomib及Flavopiridol诱导的细胞凋亡通路［11］，但发现给药前后Bcl-2的表达无明显变化。Mcl-1可能与Bortezomib、Flavopiridol诱导的细胞凋亡过程相关。Mcl-1是Bcl-2家族的一个抗细胞凋亡成员，Mcl-1与Bcl-2家族相互作用，通过细胞毒素的刺激抑制细胞凋亡［12］。在本研究中，抗凋亡蛋白 Mcl-1的蛋白表达明显下降［13］，显示 Bortezomib 联合 Flavopiridol诱导U266细胞凋亡可能与Mcl-1相关，机制尚待进一步研究。以上结果表明，Bortezomib联合Flavopiridol在体外能更好的抑制多发性骨髓瘤U266的细胞增殖，其主要机制可能为通过诱导细胞凋亡，来抑制细胞增殖［13］。

［1］Teru Hideshima，Paul G Richardson，Kenneth C Anderson.Mechanism of Action of Proteasome Inhibitors and Deacetylase Inhibitors and the Biological Basis of Synergy in Multiple Myeloma［J］.Mol Cancer Ther，2011，10：2034.

［2］Kaufman J，Gleason C，Lonial S.Treatment of relapsed and refractorymyeloma［J］.Curr Hematol Malig Rep，2009，4：99.

［3］San Miguel JF，Schlag R，Khuageva NK，et al.VISTA Trial Investigators.Bortezomib plus mel-phalan and prednisone for initial treatment of multiple myeloma［J］.N Engl J Med，2008，359：906.

［4］Dimopoulos M，Spencer A，Attal M，et al.Multiple Myeloma（010）Study Investigators.Lenalidomide plus dexamethasone for relapsed or refractory multiplemyeloma［J］.N Engl J Med，2007，357：2123.

［5］Kumar SK，Rajkumar SV，Dispenzieri A，et al.Improved survival in multiple myeloma and the impact ofnovel therapies［J］.Blood，2008，111：2516.

［6］Kumar S，Blade J，Crowley J，et al.Natural history of multiple myeloma relapsing after therapy withIMiDs and bortezomib：A multicenter International Myeloma WorkingGroup study［J］.Blood（ASH Annual Meeting Abstracts），2009，114：2878.

［7］Teoh G，Anderson KC.Interaction of tumor and host cells withadhesion and extracellular matrix molecules in the development ofmultiple myeloma［J］.Hematol Oncol Clin North Am，1997，11：27.

［8］Dankbar B，Padro T，Leo R，et al.Vascular endothelial growth factor and interleukin-6in paracrinetumor-stromal cell interactions in multiple myeloma［J］.Blood，2000，95：2630.

［9］Hideshima T，Chauhan D，Schlossman R，et al.The role of tumor necrosis factor alpha in the pathophysiology ofhuman multiple myeloma：therapeutic applications［J］.Oncogene，2001，20：4519.

［10］Mitsiades CS，Mitsiades N，Poulaki V，et al.Activation of NF-kappaB and upregulation ofintracellular anti-apoptotic proteins via the IGF-1／Akt signaling inhuman multiple myeloma cells：therapeutic implications［J］.Oncogene，2002，21：5673.

［11］Orlowski RZ，Eswara JR，Lafond-Walker A，et al.Tumor growth inhibition induced in a murine model ofhuman Burkitt＇s lymphoma by aproteasome inhibitor［J］.Cancer Res，1998，58：4342.

［12］Chauhan D，Uchiyama H，Akbarali Y，et al.Multiple myeloma cell adhesion-induced inter-leukin-6expression in bone marrow stromal cells involves activationof NF-kappa B［J］.Blood，1996，87：1104.

［13］Hideshima T，Chauhan D，Richardson P，et al.NF-kappa B as a therapeutic target in multiplemyeloma［J］.J Biol Chem，2002，277：16639.

The inhibitory effect of Flavopiridol in combination with bortezomib on the proliferation of multiple myeloma

ZHANG Wei1，DONGLi2.（1.ChangchunCentralHospital，Changchun130051，China；2.TheFourthAffiliatedHospitalof ChinaMedicalUnivercity）

ObjectiveTo discuss the protein kinase inhibitor Flavopiridol and proteasome inhibitor Bortezomi inhibition of multiple myeloma cells U266cell proliferation and its mechanism of action.Methodsdifferent concentrations of Flavopiridol and／or Bortezomib，respectively，the effects of U266cells proliferation was detected by MTT.By western blot to detect the expression of Bcl-2and Mcl-1，rearch the change of Bcl-xl，Mcl-1while U266was dealed with Flavopiridol and Bortezomib.Results①Compared with Bortezomib and Flavopiridol more proliferation of U266cells，（IC50：52.5nM，25nM）.②Compared with the drug alone，Flavopiridol and Bortezomib，while the role of U266cells with IC50values significantly reduced（IC50：17.5nM）.③Flavopiridol and Bortezomib before and after administration，the Bcl-2protein expression remained unchanged，while Mcl-1protein expression was significantly decreased.Conclusion

Flavopiridol and Bortezomib medication in the body significantly inhibited U266growth of multiple myeloma cells，and its mechanism is mainly inhibition of proliferation by inducing apoptosis.

multiple myeloma；the protein kinase inhibitor Flavopiridol；proteasome inhibitor Bortezomi；combined medication

R733.3

A

1007－4287（2013）05－0817－03

张伟，男，35岁，硕士，主治医师，研究方向：骨关节与骨肿瘤基础丐临床研究。

2012－08－24）