奥卡西平对癫患儿外周血MDR1表达的影响

戴园园 沈栋林 李 蕊 孙明霞

徐州医学院附属医院儿科 徐州 221000

1 材料与方法

1．1 临床资料

1．1．2 对照组：对照组来自于同期上呼吸道感染住院患儿，年龄6个月～12岁，平均（4．5±3．8）岁，既往无抽搐史，无慢性病史，无长期服用任何药物史。以上3组儿童年龄、性别差异无统计学意义（P＞0．05），留取血液标本征得家长同意。

1．2 方法

1．2．1 半定量RT－PCR检测：抽取外周静脉2mL，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，Trizol试剂提取细胞RNA。引物设计：β－actin为内参标准，依据GenBankBC002409应用DNAStar软件设计为扩增片段长度526bp：上游5’－CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC－3’，下 游：5’－GT－CACCTTCACCGTTCCAGT－3’；MDR1引物扩增片段长度165 bp：上游5’－AGCCCATCCTGTTTGACTGC－3’，下游5’－TGATGCGTGC2CATGCTCCTT－3’；RT－PCR采用 Tukala试剂盒 （大连宝生物公司）、PE9600基因扩增仪 （美国PERKINELMER公司）。反应体系包含5×Buffer 4μL，10 mmol／L dNTPs混合液1μL，上、下游引物各1μL，混合酶1 μL，溶解液3μL，上述反转录生成的cDNA 1μL，无RNase ddH2O 8μL，共20μL。置于PCR仪中，37℃15min逆转录，95℃15min激活进入PCR循环：94℃预变性3min，94℃变性30s，57．5℃退火30s，72℃延伸1min，内参进行33个循环。取RT－PCR产物12μL，1μL 6×溴酚兰，TAE应用TAE电泳缓冲液，2%琼脂糖凝胶电泳，电压100μV、40 mA，45min后紫外成像系统 （Vilber凝胶成像分析系统，法国Lourmat公司）观察电泳结果并照相。以特定扩增产物条带灰度值与β－actin扩增产物条带灰度值之比代表MDR1的表达水平。

1．3 统计学处理 采用SPSS 16．0软件进行处理，正态分布数据以均数±标准差表示，数据经方差齐性检验，用完全随机设计的单因素方差分析进行各组间比较，用SLD－t检验方法进行两两比较。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

OXC组外周血 MDR1－mRNA表达在用药后6个月和12个月较服药前均有增高（F＝6．32，P＜0．05）；OXC组和CBZ组2组患儿外周血MDR1－mRNA表达在用药后6个月和12个月较服药前亦有增高（F＝5．43，P＜0．05）；用药后6个月及12个月，OXC组外周血 MDR1－mRNA相对表达量和CBZ组比较差异无统计学意义（F＝2．68，P＞0．05）。见图1、表1。1、2、3、4分别为OXC组治疗后12个月、OXC组治疗后6个月、OXC组治疗前和对照组；5、6、7、8分别为CBZ组治疗后12个月、CBZ组治疗后6个月、CBZ组治疗前和对照组。

图1 MDR1／β－actin的 RT－PCR电泳结果

表1 3组患儿不同时间点外周血MDR1／β－actin比值

3 讨论

有体外实验显示［8］，OXC、CBZ及其活性代谢产物均是Pgp的底物；Clinckers等［9］应用微量透析法研究显示OXC可以增加癫大鼠血脑屏障Pgp含量，而加用耐药蛋白抑制剂丙磺舒或维拉帕米后OXC的抗惊厥疗效显著增强；Marchi等［10］应用RT－PCR法观察OXC耐药癫患者切除脑组织发现 MDR1－mRNA表达增高，推测难治性癫脑内MDR1和Pgp的表达增高和药物之间有一定关联。本研究中选择了OXC单药治疗的癫患儿，经过1a的观察，结果显示，口服OXC半年后，患儿外周血中 MDR1－mRNA表达量即开始增加，1a后MDR1－mRNA表达量较半年时增加，显示长期口服OXC可以增加癫患儿MDR1的表达，并且和时间相关，长期应用后可被Pgp识别从而限制其通过血脑屏障，降低药物在脑中的浓度，影响药物疗效。实验采用的是测外周血MDR1－mRNA相对表达量的方法，取材简易方便，有利于动态观察，癫发作后，血脑屏障受损，脑内MDR1基因mRNA及其表达产物Pgp可进入外周血内，因此，外周血MDR1基因mRNA可在一定程度上反映其在脑内的表达。

［1］Eun SH，Kim HD，Chung HJ，et al．A multicenter trial of oxcarbazepine oral suspension monotherapy in children newly diagnosed with partial seizures：a clinical and cognitive evaluation［J］．Seizure，2012，21（9）：679－684．

［2］张军利 ．奥卡西平治疗儿童部分发作性癫80例临床分析［J］．中国实用神经疾病杂志，2011，14（12）：76－78．

［3］Marchi N，Gonzalez－Martinez J，Nguyen MT，et al．Transpor ters in drug－refractory epilepsy：clinical significance［J］．Clin Pharmacol Ther，2010，87（1）：13－15．

［4］St pieńKM，Tomaszewski M，Tomaszewska J，et al．The multidrug transporter P－glycoprotein in pharmacoresistance to antiepileptic drugs［J］．Pharmacol Rep，2012，64（5）：1 011－1 019．

［5］Liu X，Yang Z，Yang J，et al．Increased P－glycoprotein expression and decreased phenobarbital distribution in the brain of pentylenetetrazole－kindled rats［J］．Neuropharmacology，2007，53（5）：657－663．

［6］Yang HW，Liu HY，Liu X，et al．Increased P－glycoprotein function and level after long－term exposure of four antiepileptic drugs to rat brain microvascular endothelial cells in vitro［J］．Neurosci Lett，2008，434（3）：299－303．

［7］Luna－Tortós C，Rambeck B，Jürgens UH，et al．The antiepileptic drug topiramate is a substrate for human P－glycoprotein but not multidrug resistance proteins［J］．Pharm Res，2009，26（11）：2 464－2 470．

［8］Zhang C，Zuo Z，Kwan P，et al．In vitro transport profile of carbamazepine，oxcarbazepine，eslicarbazepine acetate，and their active metabolites by human P－glycoprotein［J］．Epilepsia，2011，52（10）：1 894－1 904．

［9］Clinckers R，Smolders I，Meurs A，et al．Quantitative in vivo microdialysis study on the influence of multidrug transporters on the blood－brain barrier passage of oxcarbazepine：concomitant use of hippocampal monoamines as pharmacodynamic markers for the anticonvulsant activity［J］．Pharmacol Exp T－her，2005，314（2）：725－731．

［10］Marchi N，Guiso G，Rizzi M，et al．A pilot study on brain－toplasma partition of 10，11－dyhydro－10－hydroxy－5H－dibenzo azepine－5－carboxamide and MDR1brain expression in epilepsy patients not responding to oxcarbazepine［J］．Epilepsia，2005，46（10）：1 613－1 619．

［11］Fortuna A，Alves G，Falc o A，et al．Evaluation of the permeability and P－glycoprotein efflux of carbamazepine and several derivatives across mouse small intestine by the Ussing chamber technique［J］．Epilepsia，2012，53（3）：529－538．