桃果实糖、酸QTL定位和候选基因分析研究进展

张佳卉　王力荣等

摘 要：果实糖、酸含量及其比例是评价桃果实品质的重要指标。主要综述桃果实糖、酸代谢关键酶和糖、酸QTLs的定位和候选基因研究进展。桃果实糖、酸代谢基本途径关键酶有蔗糖合成酶、蔗糖酸性转移酶、山梨醇氧化酶、山梨醇脱氢酶、NADP+-苹果酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等；通过遗传连锁图谱构建和连锁分析已定位到多个糖、酸组分QTLs，绝大多数位于第1、3、4、5、6、8连锁群；通过关键酶编码基因与QTLs共座位方法，分离到一系列候选基因。结合桃基因组测序数据，总结调控桃果实糖、酸性状的可能候选基因。针对目前桃糖、酸基因定位研究中存在的问题，展望实现桃果实糖、酸基因定位和单个基因克隆的新方法。

关键词： 桃； 糖； 酸； QTLs；

中图分类号：S662.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0688-09

据世界粮农组织统计，2011年我国桃栽培面积有76.73万hm2，产量1153万t，占世界面积和产量的48.86%和53.55%，位居世界第1位（FAOSTAT： http：//faostat.fao.org/）。

品质是商品果的核心[1]，但果实品质性状多为数量性状，遗传调控机制复杂，难以把握其遗传规律。因此在育种上果实品质无法在较短时间内取得快速有效的改良，限制育种进程[2]。研究表明，在近20 a里，欧美等国家桃消费量并无增长趋势，主要原因是桃品质育种进程缓慢，品质未能更好地满足消费者需求[3]。因此，品质改良是目前桃育种的主要方向之一。桃果实内在品质主要有糖、酸、糖/酸、可溶性固形物、维生素C含量以及香气等[1]，其中糖、酸含量及糖酸比是决定果实口感的主要因素[4-7]。由此，从分子水平上阐明桃果实糖、酸遗传机理，了解种质资源的糖、酸遗传特性，对培育高品质桃品种具有重大意义。

1 桃果实糖、酸组分

桃果实可溶性糖主要有蔗糖（约占可溶性糖的54%～75%）、葡萄糖（9%～21%）、果糖（3%～25%）、山梨醇（4%～11%）等[6]。山梨醇是主要的光合产物[8]，并且果实风味在很大程度上取决于山梨醇转化为其它糖的类型[9]。但在果实成熟时山梨糖醇含量却很低。桃果实中主要有机酸有苹果酸（约占总酸的50%～60%）、柠檬酸（20%～25%）和奎宁酸（20%～25%）[10]，此外还有含量极少的莽草酸 [11-12]。

1.1 桃果实糖、酸组分与品质

研究证明，糖酸比大于20、含酸量在0.4%以下、pH大于4的桃品种以甜风味为主；糖酸比在10以下、含酸量大于0.4%以上、pH值小于3的桃品种风味酸[2]。从各组成因素而言，甜度与柠檬酸、莽草酸含量及糖酸比有关，口感与总糖、蔗糖、山梨醇和苹果酸含量以及苹果酸和柠檬酸比例有关[13]。果实香气可能与奎宁酸和莽草酸有关。奎宁酸和莽草酸是芳香物质合成途径之一—莽草酸途径的中间产物[12]，这2种有机酸可能直接转化为芳香化合物或参与芳香化合物的合成从而间接影响果实香气。桃果实各个化学组分之间有一定的关系，即糖、酸含量之间存在相关性[14]。这些组分的相关性，可能是因为糖或酸在代谢上相互联系，即糖、酸各组分在果实成熟过程中和成熟后的代谢途径相互交联。

1.2. 果实糖、酸组分代谢关键酶

DeJong等[15]认为桃果实发育过程可分为3个阶段：第I阶段，果实细胞快速分裂阶段；第II阶段，果实生长缓慢，内果皮开始硬化，为硬核期；第III阶段，果实细胞快速膨大的生长阶段。在果实发育的第I阶段，蔗糖合酶（Sucrose synthase， SS）和蔗糖酸性转移酶（Acid invertase， AI）以及山梨醇脱氢酶（Sorbitol dehydrogenase， SDH）和山梨醇氧化酶（Sorbitol oxidase， SOX）都具有活性[16-18]，说明初期山梨醇可能被转化为蔗糖和葡萄糖。Lo Bianco（2002）观察到SS、AI、SOX、SDH的活性与生长速率只在果实发育的第I、III阶段存在显著相关性[19]，而Yamada等[20]通过检测编码这些酶的基因表达情况也发现SDH仅在第I、III阶段表达。说明在果实发育过程中，这些酶催化蔗糖和山梨醇分解，一部分为果实发育提供能量，另一部分分解为其他贮存物质如葡萄糖、有机酸等。因此，这些酶参与调控果实大小和品质[19，21]。

在酸组分代谢方面，依赖于NAD+的苹果酸酶（NAD+-ME）在果实从第I阶段向第II阶段转变时，活性显著下降，而在果实膨大期到成熟期该酶的活性又恢复到果实发育初期时的活性；依赖于NADP+的苹果酸酶，在果实发育第I阶段、第III阶段活性增强；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在第III阶段活性有短暂的略微下降；柠檬酸合酶（CS）在第III阶段活性显著增加；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）（催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸）活性在果实发育初期显著增加，在果实膨大后期其活性达发育初期的50倍，果实成熟采摘后PEPCK活性更高[22]。这些结果表明第I和第III阶段是有机酸代谢旺盛期，发生一系列有机酸的合成和降解的过程，影响果实的最终糖酸含量。

综上，蔗糖合成酶，蔗糖酸性转移酶，山梨醇氧化酶，山梨醇脱氢酶，依赖于NADP+的苹果酸酶，柠檬酸合酶等是决定果实品质的关键酶，推测与糖、酸转移有关的载体和质子泵在果实品质决定中扮演着重要角色。

1.3 桃果实糖、酸含量影响因素

桃果实糖、酸组分及其代谢过程比较复杂，受遗传因素、生理、环境条件和栽培措施等多方面的影响。

王力荣[23]、吴本宏等[24]研究认为油桃基因型可溶性固形物和总糖高于普通桃。王力荣[23]研究表明油桃和蟠桃基因具有增大果实固形物的作用。王力荣[23]、吴本宏等[24]、Wen等[25]研究表明油桃基因型的可滴定酸含量高于普通桃。因此基因型对桃和油桃的糖、酸含量具有重要影响[26]。此外，成熟期、光照、温度、水分供应和其他栽培措施等也可能影响桃果实的糖、酸含量[27-32]。

影响桃果实糖、酸含量的因素较多，但遗传因素扮演重要角色。因此利用分子生物学手段发掘调控桃果实糖、酸含量的关键酶，阐明桃果实糖信号、激素信号与外界环境信号之间的联系和调控，有机酸的跨膜运输和载体蛋白的调控机制，为提高果实品质提供理论依据。

2 桃果实糖、酸QTLs研究

目前在桃上已构建多个遗传连锁图谱，通过这些图谱，定位到多个糖、酸QTLs，并分离到部分QTLs的候选基因。

2.1 桃遗传连锁图谱构建

2.2 桃果实糖、酸QTLs

目前已经定位的糖、酸相关的QTLs，绝大多数位于LG1、3、4、5、6、8，有机酸相关的QTLs主要位于LG5顶端的D基因区域，但目前尚不明确该区域内影响有机酸和总酸含量是一因多效引起，还是因为多个QTLs成簇的结果。SSC QTLs在LG1、3、4、5、6有分布，且所报道的QTLs中，主要在LG2、4、6上，蔗糖QTLs在LG3、4、5、6、7都有报道，但LG5上最多，且某些QTL在不同定位群体都能够被检测到；葡萄糖QTLs在LG 1、4、5、6、7、8都被检测到，但主要分布在LG4。另外，果糖QTLs主要分布在LG4，位置与很多SSC的 QTLs重合，这可能意味着LG4存在调控果糖和SSC含量的QTL或者QTL簇；山梨醇、柠檬酸、草莽酸、苹果酸和奎宁酸所检测到的QTLs数目都比以上其他性状少，并发现某些报道的位点所解释的表型变异都较高，如山梨醇在LG6上的QTL解释75.1%的表型变异，柠檬酸在LG5的QTLs解释81.7%的表型变异，苹果酸在LG5在多个群体中都被检测到解释很大比例的表型变异，奎宁酸在LG6有2个解释表型变异率较高的位点（35.1%和43.1%），草莽酸主要在LG3。这些解释较大表型变异的QTL 区域，特别是在多个群体中都被检测到，可能存在着调控这一性状的关键基因[2，44，49-50]。

2.3 桃果实糖、酸QTLs的精细定位与候选基因

Ebenezer等[41]通过分子标记和候选基因图谱与其他图谱对比分析，将候选基因类比锚定到其他图谱上，以此推断并验证这些图谱上已定位到的QTL的候选基因。通过与T×E图谱对比，在LG5顶端D基因区域，相应的基因是过氧化氢酶（Catalase，Cat）基因位点Cat1。通过与Dirlewanger等[40]利用‘ Ferjalou JalousiaבFantasia构建的图谱对比，发现在LG6上定位到的与SSC和鲜果重有关的QTLs对应的候选基因有丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶基因（Alanine-glyoxylate aminotransferase， AGAT）、C端磷酸化酶样结构域基因（C-terminal domain phosphatase-like，CDPTL）、超氧化物歧化酶基因（Superoxide dismutase， SOD）、碱性螺旋-转角-螺旋转录因子（BZIP transcription factor， bZIP）和谷氨酸葡萄糖-6-磷酸合成转移酶基因（Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase， C-PPN）；LG4定位到的SSC和果糖含量QTLs[2]相应的候选基因是倍半萜烯环化酶基因（Sesquiterpene cyclase， SeCy）、S-腺苷甲硫氨酸-2-甲基萘醌甲基转移酶基因（S-adenosylmethionine： 2-demethylmenaquinone methyltransferase， SAMM）和甘油磷酰二酯酶基因（glycerophosphoryl diester phosphodiesterase， GDPPDE）。这些候选基因在基因克隆和功能研究中有一定的参考价值。

2.4 桃全基因组测序

3 讨 论

桃果实品质提升主要是糖、酸含量及其比例的改良。目前通过连锁分析已定位到多个糖、酸性状相关QTLs，并在一些区域筛到相应候选基因；部分QTLs对某一糖、酸组分贡献率较大，推测这个区域可能存在调控果实糖、酸含量的重要基因。这类QTLs的存在说明糖、酸组分可能受若干主效基因和多个微效基因的调控，因此可通过筛选主效QTLs进行品质改良。在第5连锁群顶部定位到低酸位点（D位点），在多个研究中都被检测到[44，53，55]，说明其可能普遍存在于桃群体中；该位点存在苹果酸、蔗糖、柠檬酸、pH和可滴定酸相关的QTLs；研究发现D基因位点可降低有机酸含量和增加蔗糖含量[44]，对提高糖酸比十分有利，在育种上有重要价值，应给予重视。

目前的研究在一定程度上推动了对桃果实品质遗传机制的认识，但也存在一定的问题。一是连锁分析选用两个亲本杂交的群体作为研究对象，体现的是两个等位基因之间的差异，基因的广度窄，导致所构图谱多态性低，较大比例的标记在后代群体中表现为单一同态[3，56]。不能充分了解种质资源群体的糖酸遗传背景，不利于调控品质的优异等位基因的发掘，限制了种质资源的运用价值。桃起源于我国，种质资源丰富，其中野生资源可能存在调控糖酸和抗性的优异等位基因。如吴本宏测定野生种和栽培种的杂交后代果实中主要糖、酸含量，结果显示杂交后代糖、酸含量具有明显超亲现象，说明野生桃基因组中可能存在提高受体栽培种糖、酸含量的QTLs[11]。所以通过高世代回交将野生种质中的优异基因导入到优良栽培种中，不仅可获得抗病性强的栽培种，还可获得高糖、酸含量的优异栽培种。二是未实现调控糖、酸性状基因的克隆。基因克隆和功能分析是对基因进一步运用的基础。目前已鉴定到某些标记与调控糖、酸的关键QTLs紧密连锁，但这些标记可能仅在某两个亲本间存在多态性，而在其它品种上不存在多态性，因此不能作为选择标记对基因型进行有效选择。目前，在水稻上，通过基因克隆，研究基因序列在种质资源中的变异，根据这些变异设计一套相应的功能标记作为选择标记，可在育种中对某一基因型进行检测[57]。该方法在桃分子育种中有可借鉴之处。综上，连锁分析结果在桃育种上的应用十分有限。

4 展 望

桃基因组测序数据和功能基因注释信息的公布极大地推动桃基因定位和克隆的进展。目前通过桃基因组测序和基因注释，共预测有27852个编码蛋白和非编码RNA的基因[58]。因此，对于某一个糖、酸QTL，可参考QTL所在标记区间内的基因组注释信息而获得候选基因，再验证候选基因，筛选目的基因，实现单基因的精细定位和克隆。这在一定程度上克服林木生长周期长而不易构建高世代群体进行基因图位克隆的缺点。

关于桃果实糖、酸QTLs研究中存在的基因广度窄的问题，目前提出的基于连锁不平衡（Linkage disequilibrium， LD）的关联分析（Association analysis），根据基因历史重组事件鉴定可能存在的重要农艺性状QTLs位点的方法或有一定的可行性[59]。进行关联分析的最大优点是无需构建专门的作图群体，以来自不同生态群的地方品种组成的自然群体和野生资源等为材料，不受传统遗传群体的“两亲本范围”限制；可检测到群体内大多数的等位基因，增加基因研究广度；若结合种质资源基因组测序数据，构建高密度单核型图谱，基因定位可精确到单基因水平[60-61]。如Huang等[62]通过测序517个栽培稻品种，发现360万个SNP，利用性状与SNP关联研究籼稻亚种14个农艺性状，发现其中6个位点与目前已克隆的基因极其靠近。我们首次将关联分析引入桃基因定位研究，通过104份中国桃地方品种，53对多态性李属SSR引物，关联定位到桃果实近核处颜色、果肉颜色、黏离核、需冷量、盛花期、果实硬度、成熟期和果实发育期等性状的QTLs[63]，研究结果与前人连锁分析结果一致，说明关联分析方法在桃基因定位中具有可行性。此外，目前提出的转录组测序和表观遗传研究，可对现有基因组数据作一定补充。转录组分析可获得多个涉及糖、酸代谢的基因，这些基因可为单QTL的定位和克隆提供参考。在实现基因克隆之后，可通过研究基因-基因互作或者表观遗传信息，探究基因表达调控机制，从分子水平了解糖、酸含量调控机制，并运用于糖、酸的分子育种，实现高品质桃新品种的选育。

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