血液科造血干细胞移植技术新进展与发展设想

陈惠仁

造血干细胞移植(HSCT)是治疗血液系统恶性疾病的有效方式之一。最近二十年，HSCT技术飞速发展，愈趋成熟，更为安全有效，已成为治愈白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统恶性疾病，及良性血液病的重要方法。随着对HSCT研究的不断深入，人们对其治疗血液病的机制有了更为理性的认识，临床疗效不断提高，逐步扩展了移植的应用领域。

1 国内外本专业学科发展简史和现状

1.1 本专业学科领域发展简史 开展骨髓移植治疗血液病的历史有100年左右，经历了实验室的发展到临床的治疗。早在1937—1939年，Schretenmeyer及Osgood等首先将骨髓细胞成分用于再生障碍性贫血的临床治疗。随后在1945年前后，由于核武器的应用，使实验性骨髓移植研究工作进展很快，在动物研究(包括小鼠、狗、猴子等)方面取得新进展。1951年，Lorenz等首先成功地进行了骨髓移植实验，使受致死剂量照射的小白鼠的存活率明显提高。1958年，Mathe等首先对5例受放射意外的伤者成功地进行了骨髓移植。1963年，Mathe首先报道了对1例难治性急性淋巴细胞白血病进行同种异基因骨髓移植，患者存活了20个月。此后十余年，骨髓移植的实验研究和临床应用有所增加。但是，由于进行骨髓移植的患者多属晚期急性白血病，加之当时对组织配型缺乏系统认识，移植效果均不理想。70年代以后，由于移植免疫学、组织配型技术等基础医学的发展，骨髓移植的实验研究和临床应用又日渐活跃。1979年，Thomas等［1］报道了用组织相容性白细胞抗原(HLA)相合异基因骨髓移植治疗100例晚期急性白血病，其中13例存活1年以上，大大鼓舞了人们对其进行深入研究，并在全世界范围内广泛开展。骨髓移植的临床疗效有了明显的提高，部分病例可以长期存活。

1.2 本专业学科领域国内先进学科技术发展现状我国于50年代末开始动物骨髓移植实验研究，1963年尝试过对患者进行骨髓移植治疗，1964年，陆道培院士取得了同卵双生骨髓移植治疗再生障碍性贫血的成功，80年代报道骨髓移植治疗白血病成功。国内骨髓移植技术发展迅速，治疗例数增加，技术的发展完善了治疗的方法。随着中华骨髓库志愿者人数的增加，非血缘关系骨髓移植技术有较广阔的发展前景。中国造血干细胞捐献者资料库已经有29个省级分库，到目前为止已登记在册并完成配型的人数达到了120多万，每年为数百例患者提供了造血干细胞。在非血缘志愿者骨髓库中能否找到HLA相合的非血缘志愿者与以下几点有关:①志愿供髓库的大小。志愿者骨髓库越大，HAL相合的可能性越大。②受者HLA单倍体表型。例如一个约10万人的志愿者库，人群常见HLA单倍体表型受者找到合适供者的可能性为90%，而人群少见表型者找到合适供者的可能性不到10%。③患者的原发疾病情况。慢性髓系白血病慢性期，患者一般情况好，有充分的时间找寻非血缘供者，因而找到的概率高于急性白血病及急性再生障碍性贫血的患者。HLA不合供者移植技术的发展，解决了骨髓源问题，HLA不合移植具有以下特点:①供者来源更加广泛。②成本低。建立及维持非血缘关系供者库需要大量投资，而亲属部分相合的供者则不需要特殊费用。③从伦理及技术方面讲，其有更强的可操作性，由于亲情关系的存在，供者的捐献意愿更强，且当再次需要供者来源的干细胞或淋巴细胞以解决植入不良及复发等并发症时，可操作性更强，有利于总体生存率的提高。HLA配型不合移植技术成熟，已经有长期随访结果。

国内在20世纪90年代初，发现粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对动员的外周血干细胞(PBSC)免疫特性存在调节作用［2］。经G-CSF动员的PBSC中B淋巴细胞及单核细胞B7的总表达水平下调，树突状细胞(DC)数量增加，DC1/DC2比例倒置，而经GCSF动员的骨髓造血干细胞中T淋巴细胞CD28、B淋巴细胞及单核细胞B7的总表达水平均下调，DC总数量减少，DC1数量减少，DC2数量相对增加，DC2/DC1比例升高。G-CSF动员的PBSC与骨髓按2∶1～1∶2(单个核细胞数量比值)比例联合移植，其免疫活性细胞趋于形成免疫耐受［3］。Huang等［4］和Lu等［5］的研究显示，亲属HLA单倍体相合/部分相合移植体系中，急、慢性移植物抗宿主病(GVHD)发生率、受者的长期存活率及长期无病存活与同胞间HLA全相合移植的差异均无统计学意义。

1.3 国外HSCT基础和临床研究现状 骨髓移植或HSCT是治疗许多恶性血液病的有效方法，如各种急性血液病、骨髓增生异常综合征、慢性中幼粒细胞白血病、严重的急性放射病、重症再生障碍性贫血及部分其他血液系统恶性肿瘤(如恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤)。

1.3.1 基础研究:调节性T细胞(Tregs)功能与异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)，诱导免疫耐受取得进展。Tregs是维系移植免疫耐受的必要细胞，可能参与GVHD预防以及淋巴细胞恢复重建的调控，美国国立卫生院 (NIH)报道了T细胞去除的Allo-HSCT后的Tregs重建 －恢复动力学以及与GVHD的相关性［6-7］。Tregs特异性地表达Foxp3转录阻滞子(repressor)，通过测定Foxp3基因表达水平评估分析了Tregs CD4+CD25+Foxp3+细胞在移植后120 d内的恢复动力学。研究结果提示，Tregs的抑制性作用与移植后GVHD的相关性更为密切。Tregs功能(通过Foxp3基因表达测定来评估)在控制移植后异源反应性方面至为重要。这些结果支持在移植后30 d内采用体外扩增的Tregs CD4+CD25+Foxp3+细胞输注以预防GVHD的设想。Rezvani等［8］和 Golshayan 等［9］报 道 了 Tregs CD4+CD25+输注预防急性致死性GVHD，以及提高Allo-HSCT后免疫功能重建的效果。此前研究结果也已证实，Tregs CD4+CD25+可以降低主要组织相容性抗原(MHC)不合移植后实验小鼠的严重急性GVHD发生率，研究结果提示，Tregs能够在提高淋巴细胞数量和功能恢复的同时防止GVHD的发生，从而确保了移植受体的存活。目前尚不清楚Treg细胞对效应T细胞的作用是选择性的还是非选择性的，Treg细胞有可能在移植后个体体内参与调节胸腺内和外周血T淋巴细胞的成熟以及选择过程。

有关HSC归巢和植入的基础研究取得进展，由于移植的HSC数量有限(尤其是脐血移植)，其归巢和植入对提高移植效果来说至关重要，HSC能经由外周血归巢于骨髓并稳定“居住”于骨髓微环境中，关于其分子机制的研究已经取得进展。HSC归巢是一个组织非特异性的低效过程，各级造血细胞可能非特异性地随血流分布并寄居于各组织器官，而仅归巢于适宜造血微环境中的HSC能自我更新、增殖及分化［10］。不同来源的 HSC归巢能力不同，骨髓及脐血CD34细胞穿越内皮细胞能力显著低于经过动员的外周血CD34细胞;HSC归巢能力还与供受者年龄有关，利用干细胞归巢特性促进HSCT过程中干细胞归巢与植入，归巢特性为临床采集HSC也提供了新思路。

1.3.2 临床研究:国外近年来通过使用兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)、氟达拉滨(Flud)、甲泼尼龙和全身照射使HLA单倍型骨髓移植排斥率由40%降到 5% 以下［11］。Mehta 等［12］报告 210 例用ATG预处理后植入率是97%，在预防GVHD方面，体外加抗体T10B9，选择性去除引起GVHD的T细胞，移植后使重度GVHD发生率由70%降至10%～20%，临床经验支持去除T细胞有利于单倍型移植的成功。Aversa研究小组应用大剂量CD34细胞与相对低毒性的ATG、Flud、塞替派，使90%以上患者持续植入，1个月内移植相关病死率为10%［13］;2005年临床研究评价101例 HSCT结果［14］，94例稳定植入，在缓解状态的急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)移植后无病生存率是48%和46%，改善了白血病的不良预后。

2 我军HSCT发展现状及研究成果

2.1 本学科技术发展现状 北京军区总医院80年代初就在临床成功开展HSCT技术，是全国较早开展该项技术的单位之一，经过二十多年的努力奠定了很好基础。配型相合的同胞和非血缘关系Allo-HSCT，具有并发症少等优点，移植成功率为85% ～95%。单倍型移植(父母为子女、子女为父母、同胞间)具有突破性进展，改良预处理方案避免过强的不良反应，建立G-CSF动员骨髓调节免疫功能的HSCT方法，临床效果显著［15-16］。国内首次报告不去除T细胞单倍型移植免疫重建明显快于去除T细胞移植，减少移植后感染。我们对128例HLA半相合移植，用全身照射10 Gy剂量，加用ATG和阿糖胞苷(Ara-C)预处理，127例植入成功。首先提出了抗白介素-2α(IL-2α)受体单抗在HLA半相合移植中可有效预防GVHD。Kaplan-Meier生存曲线计算2年无病存活率达58.2%，2年实际无病生存率是46.6%。复发状态和进展期移植的患者2年无病生存率是 30.6%，标危组移植后生存率是65.5%，差异具显著性意义，增加病例数的研究更加肯定了CD25抗体预防GVHD效果，首次得出了长期随访的病例报告［17］。国际上最完整的，最大数量的报告了单倍型移植效果，在移植存活率、GVHD发病率和移植相关病死率方面与HLA全相合移植无差异。Chen等［18］在跨越HLA不合植入屏障方面的研究取得进展，研究结果发表在国际权威《Exp Hematology》杂志，代表我国在亚太国际骨髓移植会议做专题报告，得到国内外学者肯定，在该领域居于国内领先地位，获得中华医学、军队医疗和北京市科技成果等奖项，对开拓移植骨髓源起到重要作用。我军区重视科研创新，已多次开展包括二次单倍型移植的高难度移植手术，术后均获得满意的疗效，属国内首次报道，在治疗难治性复发性白血病方面建立了初步方法。

2.2 全军开展造血干细胞研究的成果 全军在基础研究和临床工作方面成绩十分突出，军事医学科学院、解放军307医院和解放军总医院基础研究都有进展。解放军307医院开展间充质干细胞(MSCs)在移植中的应用。MSCs是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，存在于骨髓、脂肪组织、脐血及多种胎儿组织，可分泌多种细胞因子及生长因子，促进HSC的增殖与分化，MSCs还具有免疫调节、抗炎和组织修复作用，可减轻GVHD及其他移植相关并发症，在临床预防和治疗GVHD方面已经取得成绩［19-20］。乔建辉等［21］探索放射病救治基础和临床工作，建立军队放射病研究所，报告了Allo-HSCT治疗重度骨髓型急性放射病的效果，为骨髓型急性放射病的治疗提供方法。全国每年完成Allo-HSCT 1500～2000例，其中军队医院完成1000例，且非血缘移植和配型不合移植技术，处在国内领先地位。放射病治疗的核心是放射后造血重建，解放军307医院成立全军放射病研究所，多次承担核辐射事故的抢救工作，在放射病救治方面为国内疗效最好的单位，多次获得上级表彰。

3 北京军区HSCT技术发展思考

3.1 深入开展临床工作 目前能够开展HSCT技术的是北京军区总医院和解放军白求恩国际和平医院，该技术复杂，需要投入经费和提高医院整体技术水平，北京军区总医院在单倍型移植方面有特色，将继续开展单倍型移植临床工作，提高难治性复发性白血病治疗效果。该项工作在国内首先开展，具有理论基础，取得了学术地位。由于重复性好，单倍型移植工作仍在延续中。本专科临床上每年完成Allo-HSCT 100例左右，是国内较大的开展HSCT的单位之一，其中2/3是半匹配Allo-HSCT，为难治性复发性白血病的治疗提供新途径。

3.2 加强学术科研工作 重点围绕临床诊治中迫切需要解决的问题进行应用性基础和临床研究，形成了鲜明的医疗特色和医、教、研相互促进的良性循环发展模式。增加诱导免疫耐受的工作，特别探讨Tregs的抑制性与移植后GVHD的相关性。研究移植后复发预防的基础研究，预处理、移植免疫、移植物抗白血病效应，改善白血病预后。在现有经费、设备和条件下，积极增加投入，改善实验室研究条件，加强与国外领先单位合作，提高基础研究水平，建立理论根据，每年发表高水平论文5～10篇，争取建成全军专科中心。

3.3 技术和科技建设 确定研究方向和内容，努力实现以下目标的研究，建立更加完善的脐带血移植方法，相对于骨髓移植发生移植排斥的危险性小，在早期造血及免疫系统恢复延迟，但移植后复发率及移植相关病死率两者无明显差异。国外研究资料显示，脐带血在移植领域有很好应用前景，脐带血移植在儿童患者中的应用已被证实是成功的，目前，脐带血移植的应用领域也在逐步扩展，成功用于成人并取得肯定的疗效，为临床实践的进步建立理论基础［22-23］。研究NK细胞及KIR分子植入与抗复发问题，对提高单倍型相合移植疗效有重要意义。单倍型移植是治疗难治性复发性白血病最有效方法，但是复发性白血病移植后仍存在较高复发率，特别是淋巴细胞白血病。KIR为狭义Ig超家族分子，表达在NK细胞和部分T细胞表面，可与靶细胞表面的MHC I类分子结合，传导激活或抑制信号。移植后T细胞的免疫识别分为直接识别和间接识别［24］，即T细胞根据分子模拟原理直接识别同种异体的HLA分子和间接识别自体APC细胞上提呈的同种异体抗原。继续深入探讨NK细胞与移植后复发的关系，进一步研究KIR分子检测与疗效关系，寻找预防移植后复发的方法。单倍型骨髓移植越来越受到全世界血液病专家的重视，虽然目前其发展现状尚不能与全相合的骨髓移植相提并论，但从发展趋势看完全有可能在恶性血液病的根治方面占有更重要的地位。广泛开展移植后G-CSF动员PBSC的应用研究，阐明GVHD和GVL分离的理论基础。

3.4 为我国军事医学作贡献 HSCT技术的军事学特征在于对放射病的治疗。随着核技术的发展以及核扩散危险的日益紧迫，与之相关的放射病会因此呈现暴发趋势，因此，军队医院尤其应重视HSCT临床治疗和基础研究工作，解决受照后移植的时机，用全身照射模型评估照射剂量的实验室指标;免疫抑制剂的调整;并发症防治，移植后重度GVHD、植入物排斥和间质性肺炎等问题。

［1］Thomas E D，Buckner C D，Clift R A，et al.Marrow transplantation for acute nonlymphoblastic leukemia in first remission［J］.N Engl J Med，1979，301(11):597-599.

［2］梁旭，黄晓军.rhG-CSF未经动员与动员后供者外周血淋巴细胞与干细胞采集物的细胞构成及功能比较［J］.中华内科杂志，2007，46(7):566-568.

［3］Luo X H，Chang Y J，Xu L P，et al.The impact of graft composition on clinical outcomes in unmanipulated HLA-mismatched/haploidentical hematopoietic SCT［J］.Bone Marrow Transplant，2009，43(1):29-36.

［4］Huang X J，Chang Y J，Zhao X Y.Maintaining hyporesponsiveness and polarization potential of T cells after in vitro mixture of G-CSF mobilized peripheral blood grafts and G-CSF primed bone marrow grafts in different proportions［J］.Transpl Immunol，2007，17(3):193-197.

［5］Lu D P，Dong L，Wu T，et al.Conditioning including antithymocyte globulin followed by unmanipulated HLA-mismatched/haploidentical blood and marrow transplantation can achieve comparable outcomes with HLA-identical sibling transplantation［J］.Blood，2006，107(8):3065-3073.

［6］Hanash A M，Levy R B.Donor CD4+CD25+T cells promote engraftment and tolerance following MHC-mismatched hematopoietic cell transplantation［J］.Blood，2005，105(4):1828-1836.

［7］Taylor P A，Lees C J，Blazar B R.The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+)immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality［J］.Blood，2002，99(10):3493-3499.

［8］Rezvani K，Mielke S，Ahmadzadeh M，et al.High donor FOXP3-positive regulatory T-cell(Treg)content is associated with a low risk of GVHD following HLA-matched allogeneic SCT［J］.Blood，2006，108(4):1291-1297.

［9］Golshayan D，Jiang S，Tsang J，et al.In vitro-expanded donor alloantigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells promote experimental transplantation tolerance［J］.Blood，2007，109(2):827-835.

［10］Christopherson K W，Hangoc G，Mantel C R，et al.Modulation of hematopoietic stem cell homing and engraftment by CD26［J］.Science，2004，305(5686):1000-1003.

［11］Henslee Downey P J，Godder K，Abhyankar S，et al.Sequential immuno-modulation to achieve engraftment and control graft-versus-host disease across mismatched MHC barriers.The American Society of Hematology Educational Program Book，1999:389-394.

［12］Mehta J，Singhal S，Gee A P，et al.Bone marrow transplantation from partially HLA-mismatched family donors for acute leukemia:single-center experience of 201 patients［J］.Bone Marrow Transplant，2004，33(4):389-396.

［13］Aversa F.Focused workshop on haploidentical stell cell transplantation［J］.Blood Cells Mol Dis，2004，33(3):176-205.

［14］Aversa F，Terenzi A，Tabilio A，et al.Full haplotypemismatched hematopoietic stem-cell transplantation:a phase II study in patients with acute leukemia at high risk of relapse［J］.J Clin Oncol，2005，23(15):3447-3454.

［15］Ji S Q，Chen H R，Wang H X，et al.Comparison of outcome of allogeneic bone marrow transplantation with and without granulocyte colony-stimulating factor(lenograstim)donor-marrow priming in patients with chronic myelogenous leukemia［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2002，8(5):261-267.

［16］陈惠仁，何学鹏，司英健，等.氟达拉滨替代环磷酰胺的预处理方案用于单倍型造血干细胞移植［J］.中华血液学杂志，2009，30(8):514-518.

［17］Ji S Q，Chen H R，Yan H M，et al.Anti-CD25 monoclonal antibody(basiliximab)for prevention of graft-versus-host disease after haploidentical bone marrow transplantation for hematological malignancies［J］.Bone Marrow Transplant，2005，36(4):349-354.

［18］Chen H R，Ji S Q，Wang H X，et al.Humanized anti-CD25 monoclonal antibody for prophylaxis of graft-vs-host disease(GVHD)in haploidentical bone marrow transplantation without ex vivo T-cell depletion［J］.Exp Hematol，2003，31(11):1019-1025.

［19］宁红梅，金建刚，扈江伟，等.人骨髓间充质干细胞体外对异基因T淋巴细胞表型的影响［J］.中国实验血液学杂志，2005，13(1):43-49.

［20］张伟，葛薇，李长虹，等.骨髓间充质干细胞通过上调CD8+CD28－T细胞抑制T细胞的增殖［J］.中国实验血液学杂志，2004，12(5):666-669.

［21］乔建辉，余长林，郭梅，等.异基因外周造血干细胞移植治疗极重度骨髓型急性放射病一例［J］.中华器官移植杂志，2007，28(9):561-563.

［22］Somers J A，Brand A，Hensbergen Y，et al.Double umbilical cord blood transplantation:a study of early engraftment kinetics in leukocyte subsets using HLA-specific monoclonal antibodies［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2013，19(2):266-273.

［23］Eapen M，Rubinstein P，Zhang M J，et al.Outcomes of transplantation of unrelated donor umbilical cord blood and bone marrow in children with acute leukaemia:a comparison study［J］.Lancet，2007，369(9577):1947-1954.

［24］Ruggeri L，Mancusi A，Capanni M，et al.Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia:challenging its predictive value［J］.Blood，2007，110(1):433-440.