共价结合法固定化酶活性载体的研究进展

郎伟超 张丽

(南京理工大学环境与生物工程学院 江苏南京 210094)

酶的共价结合固定化是通过共价键把酶连接到带有惰性基团或者活性基团的载体上。共价结合法已经成为酶固定化的最主要的方法之一。其原理非常简单,用预先设计好的,带有活性基团的不溶性载体,在适宜的条件下与氨基酸发生反应,形成共价键。

20世纪60年代,研究发现,预先制备好的载体不仅仅是作为支撑酶的骨架,还可以使酶的性质(如稳定性、活力和选择性)发生改变。

1 活性载体的合成

活性载体是指具有活性基团,在适当条件下,能直接与酶结合的聚合物。因此,聚合物中应该至少有一种单体含有活性基团,该基团可以与酶中氨基酸残基发生反应。

1.1 含酰基叠氮的聚合物

含酰基叠氮的聚合物可以通过化学修饰直接制备得到。聚丙烯酰胺(PAAm)或者其他带有酰肼基团的聚丙烯酸都可以活化,使其连接活性酰基叠氮来结合酶。

2010年孔黎春、胡洁玲等人[1]在氟甲磺酸锌的催化下合成酰基叠氮化合物。在三氟甲磺酸锌催化下,由酰基苯并三唑与叠氮化钠,发生酰化反应。该方法的原料易制备保存、反应速度快、产率高、产物分离简单。

但是,酰基叠氮可以同很多氨基酸残基发生反应,使酶可以通过不同的连接方式固定,而且固定化后酶活力较差。因此,这类聚合物很少被用于酶的固定化。

1.2 含酸酐的聚合物

含有酸酐基团的聚合物是第二种被用于共价固定化的化合物。可以通过带有酸酐(柠檬酸酐、甲基丙烯酸酐、马来酸酐)的单体在一定条件下直接聚合成共聚物或者均聚物。这种方法可以通过改变单体或者交联剂来构建具有不同结构的载体,而且可以调节载体的疏水性能。

2010年,郑建国、张松平等[2]用静电纺丝法制备聚乙烯马来酸酐共聚物纳米材料。在聚合物浓度0.35g/mL,针尖到接收板距离为25cm,电纺液流量250μL/h,电压12kV条件下,获得了直径300nm且分布均匀的纳米材料。

但是带有酸酐基团的聚合物所带的电荷会导致酶的水解反应和疏水反应;载体所带有的羧基会使固定化酶的最适作用pH增加1-2.5个单位。此外,对于颗粒状的载体,其表面积较小。

1.3 带有卤素原子的聚合物

1970年,Brown进行了卤素置换反应。发现酶不仅可以在缓冲液中进行固定,还可以在含水量低的有机溶液中固定。

2002年,Bahar等人[3]用无孔的聚对甲基苯乙烯(PCMS)通过PEI与载体连接,制备能承载0.019转化酶的载体。其内部扩散阻力很小,可忽略不计,而且固定化酶的热稳定性是游离酶的5倍。

1.4 聚碳酸酯

自20世纪70年代开始,聚碳酸酯就已经被用于固定化酶。但是在此后的20年里,机会没有这类聚合物被用于固定化酶的报道。

黄家贤等人[4]以乙烯撑碳酸酯为聚合单体,以亲水性N,N’-亚甲基爽烯酰胺为交联剂,分别用N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸-β-羟已酯两种亲水性单体作为酶载体的成分,通过反相悬浮聚合,合成了两种性能较好的载体,它们够快速与酶反应,并且酶活力良好。

Ding LH等人发现,聚碳酸酯是可溶性的均聚物,通过交联可以得到不溶性的球状载体,可以用于固定胰蛋白酶。酶的固定量达到0.25。但是,酶的活力回收率却低于15%。原因可能是反应基团的密度升高或者是扩散阻力增大而导致酶的活力下降。湿载体的最大固定化量为0.025。

1.5 带有乙酰基的聚合物

Slotmkowski通过含乙酰基的单体聚合制备了醛基聚合物载体,该载体包含由丙烯醛合成的聚丙烯醛,聚丙烯醛是可溶于水的4-乙烯基嘧啶与丙烯醛的共聚物,该载体被用于乙醇脱氢酶和NADH的固定化。

目前,使用带乙酰基的聚合载体固定化酶的方法正渐渐失去重要性,这不仅仅是因为Schiff碱连接的不稳定性,更是因为含醛基的聚合物更容易通过基团互变技术得到。

1.6 苯酚聚合物

苯酚聚合物通常具有成本低、亲水性、易于制备等特点。较为常用的是邻苯二酚或者对苯二酚与戊二醛或者甲醛缩合反应。这类多空载体可以用于多种酶的固定化,例如:磷酸酯酶、卵清蛋白。

2 展望

载体在酶固定化技术中占有举足轻重的地位,具有优良的性能的载体能够对大幅提高酶固定化效果,因此,在固定化酶的过程中选择制备合适的的载体是非常重要的。近年来,随着化学、材料等技术的发展,固定化技术也得到了迅速发展,特别是共价结合的载体材料研究也取得了很大进展,并且有向精细化发展的趋势。因此,在对传统载体材料改进的同时,开发新型改性复合载体将成为今后研究的重点。

[1]孔黎春,胡洁玲,张龙峰.三氟甲磺酸锌催化下酰基叠氮化合物的合成[J].浙江师范大学学报,2010,33(2):185-188.

[2]郑建国,张松平,张羽飞.静电纺丝制备苯乙烯马来酸酐共聚物纳米纤维及其固定化β-D-半乳糖苷酶[J].过程工程学报,2010,10(4):743-749.

[3]Bahar T,Tuncel A.Immobilidation of invertase on to crosslinked poly(pchloromethylstyrene) beads[J].Appl Polym Sci,2002,83:1268-1279.

[4]黄家贤,霍岩丽,李涵,等.含环碳酸酯基固定化酶载体的合成及其性能研究[J].中国生物化学与分子生物学报,2001,17(3):377-380.