化学修饰改进脂肪酶催化特性的研究及食品中应用

武玉婷，李 春，* ，王晨旭，刘 宁，3，邵美丽，*

(1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030;2.国家移动实验室研究发展与评价中心，黑龙江哈尔滨150036;3.国家乳业工程技术研究中心，黑龙江省乳品工业技术开发中心，黑龙江哈尔滨150028)

通过利用化学手段将大分子或某些功能基团结合到酶分子上，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的，被称为酶的化学修饰［1］。化学修饰可以在不知道酶蛋白结构的情况下，允许大范围的化学基团快速引入到酶的结构中，使酶蛋白折叠构象发生改变，继而改变酶结构及其催化性能。目前的化学修饰的研究基本上都是针对酶侧链的修饰，主要包括酶分子表面的非选择性修饰和分子内部特异位点的选择性修饰［2］。通过选择合适的化学修饰剂及修饰方法，就可以快速、廉价地提高酶的活性和稳定性，甚至合成出新的酶。脂肪酶(又名三酰甘油酯水解酶，EC3.1.1.3)是一类能在油水界面或水不溶性系统中催化水解、酸解、醇解、胺解、酯化、转酯、酯交换等多种化学反应的生物催化剂，具有化学选择性、立体选择性、位点选择性和底物专一性等特点［3］。目前，我们对脂肪酶的结构和性能已有了大量的研究，表明不同来源的脂肪酶虽然氨基酸组成不同，但是其催化中心具有相同或相似的区域，大多数的脂肪酶的活性中心由丝氨酸(Ser)和组氨酸(His)参与组成，Ser、His与另一种氨基酸残基一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组［4］。将脂肪酶的理论研究与实际应用联系到一起对于生产具有很重要的作用。通过化学修饰的方法来改变脂肪酶的性能，对促进其工业化发展具有很大的帮助。由于化学修饰高效简便的特性，使它在酶修饰的研究中被广泛应用。本文就以脂肪酶为例，主要综述通过化学修饰来改变脂肪酶催化特性的研究进展及应用动态。

1 脂肪酶的化学修饰

1.1 关键基团的化学修饰

在酶活性中心上的关键基团的特定化学修饰是分析酶中关键基团的常见技术，化学修饰的酶可能会改变酶活性中心中的关键基团，这将使酶的活性显著下降，甚至导致酶失活［5］。将具有氨基酸特异性的修饰剂链接到酶分子中，通过酶活性的变化，以判断酶活性中心部位氨基酸的种类。2009年于忠良［6］等通过这样的方法，采用NBS(N－溴代琥珀酰亚胺)、EDC(1－乙基－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、DEPC(二乙基焦炭酸盐)、CH－T(氯胺－T)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、DTNB(5，5＇－二硫代双(2－硝基苯甲酸))等6种特异性化学修饰剂对根霉ZM－10脂肪酶进行化学修饰，研究其分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。初步探明脂肪酶分子中表现酶活性所必需的氨基酸的种类、酶活性中心部位氨基酸种类，揭示脂肪酶的结构与功能的关系，为今后根霉ZM－10脂肪酶研究提供理论和方法基础。宋欣等［7］在对丝孢酵母脂肪酶的酶学性质研究的过程中，采用相似的方法，利用不同的化学修饰剂对酶蛋白进行修饰，通过酶催化活力的改变，来分析判断酶活性中心的氨基酸残基。

但是通过化学修饰的方法只可以判断酶的部分关键基团，且具有一定的局限性。只有当修饰剂与酶关键基团具有特异性关系时，才能确定对应基团，但是无法判断对应基团的数量。而且通过失活来判断与酶活性中心的关系，这样的方法精确度较低，忽略了修饰剂对酶构象产生影响而使酶失活的现象。所以挑选具有较强专一性的修饰剂并且借助其他方法才能对酶活性中心氨基酸做出精确判断。

1.2 小分子的化学修饰

酶的化学修饰，可能会通过大量的酶表面残基修饰而改变酶的性能。酶表面的羧基、酚基和巯基等官能团，通过化学修饰链接一些小分子修饰剂发生烷基化、糖基化和酰胺化等反应，从而改变酶的性能。目前已被广泛研究应用的小分子化合物有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐等。早在1989年 Kaimal［8］等利用丁醛、异丁醛、丙酮通过还原羟基化反应提高猪胰脂肪酶的活性，现今李康［9］等采用琥珀酸酐、丙酸酐、乙酸酐来修饰Novozym 435脂肪酶，对修饰后脂肪酶的催化性能进行测定，结果显示酸酐对脂肪酶的活性、稳定性和耐有机溶剂的能力等有很大的提高。熊亚红［10］等利用邻苯二甲酸酐修饰猪胰脂肪酶，对修饰后酶的最适反应条件和酸碱热稳定性进行考察，结果反应条件和温度未见较大变化，但是热稳定性有显著提高，可见邻苯二甲酸酐的化学修饰是一种改善脂肪酶稳定性的有效方法。另一种常用的化学修饰剂就是乙二胺，胺化的羧基基团可以与乙二胺结合，在中性pH下将带正负电荷的基团相交换而改变脂肪酶的对应选择性和活性［11］。用活化后的乙二胺修饰已固定的米曲霉脂肪酶，修饰酶在变性电泳中的迁移率较未改性的脂肪酶有显著的变化，主要是由于电荷变化引起，并且需要较高浓度的阳离子去污剂，才能从固定载体上解吸下来，使得脂肪酶的稳定性在pH为5时有了显著提高［12］。

1.3 化学交联

通过化学修饰酶表面的几种不同基团间建立化学交联，而达到提高酶活性的目的。蛋白质的化学交联可以有多种情况，即可以是分子内部交联也可以是分子间或涉及到不同分子的交联［13］。在利用双或多功能基试剂作为修饰剂时，是酶蛋白发生分子内或分子间的交联。不同分子间的交联在酶固定化中应用较为广泛。通过酶的固定化技术，使酶与固定载体之间相互交联(通常使用戊二醛)，其中载体对酶起到支撑作用，防止了酶的脱落。有时，固定化方法的不同对酶修饰后功能也产生一定影响影响，Barbosa［14］等利用乙二胺和三硝基苯磺酸修饰已固定的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，结果通过共价固定的酶的活性下降了60%左右，而通过吸附固定的酶的活性增加了两倍。

1.4 聚合物的化学修饰

利用聚合物来修饰酶可以有很多的好处［15］。首先，聚合物分子可能比酶蛋白的分子还要大，结合到酶表面，可以以一种更缓和并且容易的方法来改变酶表面的性能。其次，聚合物包含了很多的活性基团，这些基团中有些性能甚至是天然酶分子所没有的。这些特征的结合使这类多功能聚合物适合于在蛋白表面提供多点式的化学交联。聚合物将会覆盖酶表面的大部分，并且会与覆盖处的基团发生反应，该反应没有距离的限制，也没有与一个点反应而产生的竞争。然而聚合物修饰的缺点就是柔韧结构的聚合物和键与键之间产生的环将会限制酶的硬化。

在高分子量聚合物修饰剂中，分子质量在500～20000范围内的聚乙二醇类修饰剂应用最广，且大分子的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)更利于降低修饰酶的抗原性，它是既能溶于水，也可以溶于大多数有机溶剂的两性分子［16］。例如，在 Ruiza［17］等对 CALB 的研究中，固定化的CALB用琥珀酸聚乙二醇进行修饰，用琥珀酸胺化的酶，可以与约14～15个PEG分子结合，使酶的性能发生改变;Godoy［18］等在已知嗜热芽孢杆菌脂肪酶(BTL2)结构的情况下，对BTL2一个单独的外部半胱氨酸残基进行定点修饰，利用活化后的葡聚糖和聚乙二醇与Cys－64的硫醇基发生二硫化物交换进行修饰，来稳定BTL2的活性状态，修饰酶的活性主要依赖于固定化的准备以及聚合物和底物。

多糖由于无毒溶于水并且具有生物相容性等优点，被多次应用于酶的化学共价修饰来提高稳定性和降低免疫原性。Siddiqui［19］等用高分子量的葡聚糖、聚蔗糖和低分子量的菊粉对CALB进行修饰，研究表明，用硼氢化钠或巯基硼氢化钠链接各种聚合糖到酶表面，对酶的稳定性都有显著的提高，用高分子量的葡聚糖不仅稳定性增强，活性的增加也极为明显。

通过化学修饰而得到的高活性的脂肪酶在利用的过程中，如能将其回收并重复使用，在其工业应用中会带来巨大的经济效益，必将成为未来酶发展的热点。王建龙［20］等利用磁性壳聚糖为载体固定脂肪酶，使酶的分离回收较方便。Yoshimoto［21］等利用戊二醛将聚乙二醇修饰的脂肪酶与Fe2+连接，形成有磁性的共聚物，并且得到的磁性酶在磁场中回收的过程中并没有损伤到酶的活性。酶的高价格必将导致其应用成本的提高，所以酶的回收利用势在必行，修饰酶的磁性化将会是未来研究的重点。

2 修饰脂肪酶在食品工业中的应用

通过化学修饰来改变脂肪酶的性能，为适应工业化生产提供了良好的基础。修饰后的脂肪酶活性的增加，提高了脂肪酶在催化过程中目标产物的产率;稳定性的增强，拓宽了脂肪酶的应用条件;选择性的变化，改变了脂肪酶专一性作用的底物。目前，利用脂肪酶在油脂酯交换合成母乳脂肪替代物和生产类可可脂以及油脂水解方面都有广泛的应用。

2.1 修饰酶在乳品工业应用

很多微生物都可以产生脂肪酶，并对乳制品的品质产生影响，如会水解乳中脂肪酸产生酸败味，当奶油被霉菌污染后，其产生的脂肪酶会使奶油酸败变苦;脂肪酶也会使干酪制品产生不良风味;在酸乳制品中也会酶解游离脂肪酸抑制发酵剂的生长［22］。虽然脂肪酶在乳制品中会这些不利影响，但是利用其对油脂Sn－1，3位特异性，催化油脂和游离脂肪酸酯交换反应合成母乳脂肪类似物，添加到婴幼儿奶粉中具有重大的意义。

Yüksel［23］等用三棕榈酸甘油酯与榛子油等游离脂肪酸在经固定化的Lipozyme TL IM催化下生产含有十八碳四烯酸的人体乳脂肪类似物。采用响应面方法对反应温度、时间和底物摩尔比这三个因素对合成人体乳脂肪类似物的影响。这种脂肪类似物可以应用于婴儿配方奶粉中，其中含有的多不饱和脂肪酸对人体健康有着重要的作用。

Esteban［24］等用 Sn－2 位富含棕榈酸的甘油三酯和游离的油酸来合成结构油脂OPO(1，3－二油酸－2－棕榈酸三酰甘油列为新型营养强化剂用于婴儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品，并规定其含量不少于40%)。通过筛选不同来源的微生物脂肪酶，在无溶剂的条件下酸解反应合成OPO。且以棕榈硬脂酸为原料合成的结构油脂中Sn－2位棕榈酸含量为66%并Sn－1，3位油酸含量为67.5%，比人乳含量的44.8%要高很多。

2.2 修饰酶在油脂加工中的应用

脂肪酶可以催化油脂水解反应，这在肥皂制造工业上广泛应用。也可以催化酯与酸或醇发生酯交换反应，改变油脂的性质。Rodrigues［25］等结合两种不同的脂肪酶共同作用，酶法水解大豆油。Ferna’ndez－Lorente［26］等利用通过物理或化学修饰的脂肪酶来释放鱼油中的不饱和脂肪酸。Liu［27］等利用脂肪酶催化猪油和三硬脂酸甘油酯发生酯交换反应在二氧化碳超临界状态下合成可可脂。

3 结语

众多科研工作者利用化学修饰的方法改善脂肪酶催化活性，已成为前沿研究的热点。脂肪酶作为催化合成结构油脂的重要催化剂，许多酶的结构和作用机理逐渐被揭示，在理论和工业应用上都有重要的意义。利用化学修饰的方法快速有效的提高脂肪酶的活性、稳定性以及专一性，甚至合成新的酶，成为未来发展的重点。所以通过化学修饰来产生更适于工业化生产的生物催化剂具有诱人的发展前景。

然而化学修饰也有一定的局限性，在未知酶结构的情况下，酶与修饰剂的特异性结合是相对的，如多位点结合将产生非均一的混合物，对修饰酶的分析会产生一定影响。所以更加深入的了解酶结构对挑选适合修饰剂及提高酶的性能有着重要的意义。

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