逆转录病毒介导的RNAi抑制小鼠生精细胞Zfy基因表达的研究

马军德，贾斌，马世俊，申红，张挺军，付维明，蔡国宝

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2新疆兵团第九师师机关，额敏834609；3新疆兵团第九师165团畜牧兽医工作站，额敏834609）

哺乳动物中，睾丸决定因子（TDF）位于异型个体的遗传组中，并引起具有双向潜能的性腺原基分化成睾丸［1］。在 Y染色体短臂（Yp11．3）靠近常染色体的区域上，存在一种可编码锌指蛋白的高度保守的基因序列，即锌指结构基因（Zinc－finger Y，Zfy）［2］。研究发现，在所有哺乳动物个体中均可检测到Zfy基因的序列，且Zfy－1存在于小鼠性别决定区域中，因此推测Zfy基因就是TDF［3］。经研究发现Zfy基因是小鼠精子发生过程中的重要基因，位于Y染色体短臂上，在精母细胞粗线期到圆形精细胞的发育阶段表达，圆形精细胞中的含量最高。其作为一个较强的转录激活因子，能够引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，可能在精子变态过程中对某些基因具有转录激活作用［4］，与精子的发生有关［5］。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是由一些siRNA引起与其序列互补的单链RNA发生降解的现象。其可以高效特异地阻断细胞内特定基因的表达，促使特定基因mRNA降解，诱导细胞表现出特定基因缺失的表型［6］。实验研究用来表达siRNA的工具主要有质粒载体和病毒载体［7］，其中质粒载体最为常见。然而将载体有效地导入哺乳动物细胞一般需要借助转染试剂，这种外源基因的导入方法因存在无法准确地确定转染效率、难以保证每次实验的可重复性、不能在体内产生长期的效应，限制了它在哺乳动物中的应用［8］。利用病毒载体介导产生的小分子干扰RNA可以靶向感染宿主细胞实现稳定、高效的基因沉默效果，避免了由于质粒转染效率低带来的各种问题［9］。

本研究以逆转录病毒载体pMIG为基础，构建一种新的RNA干扰逆转录病毒载体，并以小鼠的Zfy基因为靶点，验证Zfy基因沉默效果，旨在为进一步探究该基因在小鼠生精过程中的作用机制及功能奠定了基础，同时也为研究生精过程中的其它基因提供了一种新的思路。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验动物

昆明小鼠由石河子大学实验动物中心提供，按常规方法饲养及传代，取25日龄左右的小鼠用于生精细胞的分离。

1．1．2 主要试验试剂及仪器

DMEM干粉培养基（Gibco），胎牛血清（FBS，Gibco），胶原酶IV（Sigma），透明质酸（Sigma），胰蛋白酶（Amresco），非必须氨基酸（Gibco），丙酮酸（Sigma），及其它工作培养液；限制性内切酶（EcoRⅠ、Bgl II）购自TaKaRa公司；无内毒素质粒试剂盒购自北京天根生化有限公司；氨苄青霉素购自沃德生物公司；高效转染试剂盒（HET）购自百恩维生物科技有限公司；SYBR＠ Premix Ex TaqTM购自TaKaRa公司；逆转录病毒载体pMIG、病毒包装质粒pUMVC及包膜质粒VSVG，人胚肾细胞293T细胞，DH5α感受态细胞均有石河子大学预防兽医学实验室保存；细胞培养箱、荧光显微镜。

1．2 方法

1．2．1 逆转录病毒重组质粒的构建

根据本实验室前期设计筛选的Zfy基因RNA有效干扰序列，委托上海生工合成2条寡聚核苷酸：5′－AATTCCAACAGTGTGAGCTTCAAATTCAA GAGATTTGAAGCTCACACTGTTGTTTTTTGGA AA－3′和5′－GATCTTTCCAAAAAACAACAGTGTG AGCTTCAAATCTCTTGAATTTG AAGCTCACAC TGTTGG－3′。

该序列基本组成如下：酶切位点（EcoRⅠ）＋Sense＋loop＋Antisense＋终止信号＋酶切位点（Bgl II）。互补的2条 Oligo DNA 分别溶于去离子水，稀释成100μmol／L。分别加入与上述配对的上游、下游单链寡核苷酸片段，按照1∶1的比例进行混合后，在PCR仪上以95℃30s，72℃2min，25℃2min的程序合成双链DNA，稀释保存备用。

原质粒pMIG－hoct3／4经 EcoRⅠ、Bgl II双酶切，回收大片段。将2对正确合链的双链shRNA模板分别与线性化载体进行连接，16℃孵育过夜，转化入DH5α，挑取阳性单克隆，酶切鉴定并送华大基因测序验证。测序鉴定正确的重组质粒命名为pMIG／ZFY－siRNA。

1．2．2 逆转录病毒颗粒的制备

将293T细胞种植于10cm细胞培养板中（约1×107个细胞），培养至待细胞状态良好。将测序鉴定正确的pMIG／ZFY－siRNA质粒与包装质粒pUMVC和包膜质粒VSVG用高效转染试剂盒（HET）共转染至对数生长期293T细胞，培养6～8h后换液并加入新鲜的细胞培养液继续培养，同时设立阴性空载体对照。72h后收集病毒上清于4℃，12000r／min离心10min以除去细胞碎片，应用0．45m滤器过滤，置于15000r／min高速离心机离心90min。将获得的病毒液分装在病毒管中，－80℃保存备用。取少量病毒原液采用孔稀释法测定病毒滴度，稀释后依次感染293T细胞，培养48h后通过观察计数荧光量以测定和计算病毒滴度。包装的病毒记为Viral vector／ZFY－siRNA，阴性对照记为 Negative control。

1．2．3 小鼠生精细胞的分离、培养及病毒感染

选取25日龄左右的昆明小鼠颈椎脱臼法处死，75%的酒精进行腹部皮肤消毒，置于超净台上切开皮肤及皮下组织取出双侧睾丸，放入冰冷的DHanks溶液中。剥除睾丸被膜，冲洗睾丸实质，用D－Hanks冲洗2次，加入相当于组织10倍体积的1 g／LⅣ型胶原酶＋20μg／mL DNAsePBS溶液在37℃5%CO2培养箱中15min，然后1000r／min离心1min后除去上清，用F12／DMEM洗涤2次，1000 r／min离心1min，将其剪碎成约1mm3大小。加入含1．5g／L透明质酸酶和0．25%胰蛋白酶＋20 μg／mL DNAse的PBS 37℃5%CO2培养箱中10 min（在此期间，摇动试管3次），以消化基底膜和管周细胞。倒置显微镜下见曲细精管段软散，让其消散成单细胞或小的细胞团即可。加入含10%胎牛血清、1%青链霉素的新鲜F12／DMEM培养液终止消化，吹打8～10次，制成单细胞悬液。用100μm滤网过滤后将滤液转入离心管，1000r／min离心10 min轻轻的去除上清。用F12／DMEM洗涤2次（1000r／min离心10min去上清），将这些生精小管碎块放入含10%胎牛血清的HamF12／DMEM培养液中，内添加必需氨基酸、表皮生长因子等，然后按约1×106个／cm2的密度接种于六孔板中，在32℃5%CO2、湿度为95%的条件下培养。24h后更换新鲜培养基，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态变化，并采集图像。待生精细胞融合度达70%～80%，生长状态良好时，用包装好的逆转录病毒和阴性对照分别对其进行转染，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光检测转染效果。

1．2．4 Zfy基因mRNA表达水平的检测

72h后，采用Trizol（美国Invitroger）法提取细胞RNA，由宝生物TaKaRa公司提供的反转录试剂盒进行cDNA合成。利用荧光实时定量PCR方法检测Zfy基因的mRNA表达水平，所用目标基因Zfy 引 物 上 游 序 列 为 5′－TTTCCGTCACCCATCAGCACTC－3′，下 游 为 5′－AAAGTCAGGAGACAGATGCCACA－3′，扩增产物为174bp。内参基因 GAPDH 引 物 上 游 序 列 为 5′－ACCCAGAAGACTGTGGATGG－3′，下游为5′－CACATTGGGGGTAGGAACAC－3′，扩增产物为171bp。

荧光实时定量PCR反应体系的总体积为25 μL，其中包含SYBR＠ Premix Ex TaqTM（Perfect Real time染料法实时荧光定量试剂盒）12．5μL，上下游引物（10μmol／L）各0．5μL，cDNA模板2μL，dd H2O 9．5μL。PCR反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸15s，30个循环。试验对所有样本进行3个重复，并在每次试验时设ddH2O为阴性对照。

2 结果与分析

2．1 逆转录重组RNAi质粒的酶切鉴定和测序验证

构建的重组RNAi质粒pMIG／ZFY－siRNA，经转化感受态大肠杆菌DH5α扩增后，进行双酶切鉴定，经酶切的重组质粒出现2条带，没有进行酶切的质粒只有1条带，说明目的基因已成功插入线性化载体pMIG中。筛选酶切鉴定正确的阳性克隆送华大基因公司测序验证，结果证实插入的序列与设计的序列完全一致，无碱基突变。测序结果见图1。

2．2 病毒包装及滴度测定

逆转录病毒重组质粒pMIG／ZFY－siRNA、包装质粒pUMVC及包膜质粒VSVG经高效转染试剂盒（HET）转染至293T细胞后荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光蛋白（图2a、b）。说明重组质粒成功转染至该细胞并已进行病毒包装，且转染效率达80%左右。

根据孔稀释法检测荧光蛋白的表达量计算病毒滴度（TU／mL）＝荧光细胞率（%）×细胞总数×病毒液稀释倍数／病毒液体积（mL），测定滴度为5×108TU／mL，可用于后期实验。

2．3 生精细胞的形态学特征及逆转录病毒感染效果

从睾丸经组合酶法分离的生精细胞，24h后可见一些由多个细胞的聚集，形成的细胞集落生长于支持细胞饲养层上，集落中的细胞大小均一、饱满呈圆形，轮廓清晰，以单个或数个连在一起依次排列，细胞之间紧密连接呈念珠状或团状，支持细胞扩展开来，呈多角形或不规则形。细胞集落少数贴壁生长，大部分以悬浮或半悬浮状态生长。待六孔板中培养的生精细胞数目达到70%～80%后，将包装病毒和阴性对照转染入所培养的生精细胞。48h后经荧光显微镜检测荧光蛋白，可以达到40%以上的感染效果（图3a、b）。

2．4 荧光实时定量测定Zfy基因mRNA的表达水平

利用qRT－PCR检测经细胞转染后病毒干扰组与阴性对照组和空白对照组Zfy基因mRNA的表达水平。测定结果见图4。

由测定结果（图4）可以看出，转染逆转录病毒的试验组，Zfy基因mRNA表达水平较阴性对照组和空白对照组显著下降（P＜0．01），而阴性对照组和空白对照组Zfy基因mRNA表达水平无显著性差异（P＞0．05）。

3 讨论

Zfy／Zfx分别位于X／Y染色体上的特异性基因，它们是染色体上编码锌指蛋白的1对等位基因，从减数分裂期开始表达，在圆形精子细胞中的含量最高。Page等［10］明确指出Zfy基因与性别分化、精子发生有关。进一步研究发现Zfy基因位于Y染色体短臂（Yp11．3）上，有11个外显子和1个随机重复区域的13个“锌－指”结构［11］，约有801个氨基酸，30个氨基酸残基，由2个半胱氨酸和2个组氨酸配位1个锌离子构成［12］。它具有2个核定位信号区和DNA结合位点，能够特异性的与靶基因结合，引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，其编码蛋白可能作为转录因子，在精子形成过程中具有一定功能［13］。因此，本研究利用RNA干扰技术有效地抑制了生精细胞内Zfy基因的表达，这一结果为进一步探究Zfy基因在生精过程中的作用和功能奠定了基础。

自从1998年Fire等［14］将dsRNA诱导的转录后基因沉默现象命名为RNAi以来，这种可诱发高效基因沉默效应的技术受到研究者的大力推广并得到迅速发展。与传统基因敲除技术、反义RNA技术及负性突变等基因沉默技术比较，RNAi具有特异性强、效率高、成本低、周期短、操作简单等不可比拟的优势［15－16］，因而被广泛应用于功能基因组研究、基因治疗等领域。本实验利用siRNA介导的RNAi技术实现了对靶基因Zfy表达的精细调控，达到了研究的目的，同时也为研究生精过程中其他相关基因的诱导调控开辟了新的思路。

质粒和病毒载体介导的RNAi技术向哺乳动物细胞中导入小分子干扰RNA（siRNA）能取得有效的基因沉默［17］。我们所使用的逆转录病毒载体pMIG多克隆位点中插入了绿色荧光蛋白，因此，通过荧光显微镜下的荧光强弱可以判断siRNA的转染效率。携带干扰片段的病毒载体进入细胞后，siRNA将持续产生，并通过识别、降解具有同源序列的mRNA，最终干扰目的基因的表达；这种逆转录病毒载体可以包装成逆转录病毒，用于转染比较难转染的细胞系，从而提高了细胞的转染效率，拓宽了RNAi的应用范围。

采用适当的程序及消化方法是分离良好单细胞悬浮液的关键环节之一。由于曲细精管含有胶原纤维，大多研究采用了胶原酶消化法。本实验在参考相关文献［18－20］方法的基础上，采用组合酶法通过对酶浓度、消化时间探究，用低浓度胶原酶Ⅳ消散睾丸间质并释放大部分管周细胞，最低程度减少了间质组织及管周细胞的污染；用胰蛋白酶消化时加机械吹打至组织块完全消化为止，完全释放出生精细胞和支持细胞。结果表明，这种程序性的消化过程能有效地分离到较为纯粹的曲精细管段并制备出较高活率的单细胞悬液，同时确保绝大部分间质成份、管周细胞及睾丸外细胞的去除。因此本研究认为胶原酶和胰蛋白酶的组合是分离小鼠生精细胞较为简单、有效的方法。

逆转录病毒转染小鼠生精细胞并筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养。采用荧光实时定量PCR检测生精细胞中Zfy基因mRNA的表达水平，结果显示，转染逆转录病毒干扰载体的生精细胞中Zfy基因mRNA表达水平较对照组极显著降低，而转染阴性对照组和空白对照组Zfy基因mRNA表达水平无明显变化。说明本研究中的逆转录病毒RNAi载体能特异、高效地抑制目的基因Zfy表达，为进一步研究Zfy基因的作用和功能奠定了基础。

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