小肠粘膜下层细胞相容性的研究进展

张承旻

（遵义医学院附属医院 贵州 遵义 563099）

1 背景

小肠粘膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是将小肠去除浆膜层、肌层及黏膜层，以及一系列加工和消毒处理后，获得的一种不含细胞的细胞外基质。是一种理想的组织工程学材料。其在组织修复方面具有3方面的生物学优势。1、组织相容性：SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白构成，并含有丰富的纤维连接蛋白［1］及生长因子，即使经过一系列加工处理后SIS仍还有这些生长因子［2、3］。如成纤维细胞生长因子－2、转移生长因子－β、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子等。这些物质均为正常细胞外基质的成分。其中Ⅰ型胶原蛋白及纤维连接蛋白均可于细胞膜特异性结合，并激活细胞传导通路促进细胞的粘附［4］；而各种生长因子也可以刺激细胞增殖。SIS不仅能为宿主细胞提供附着和迁移的自然环境，还能很快与宿主组织结合，促进血管生成，恢复组织功能。2、免疫原性和安全性：经过机械法和化学法联合处理的SIS不含细胞，其携带病原体的概率很低，而且其免疫原性弱，即使异种移植后亦不产生排斥反应［5］。SIS经消毒处理后，所含有的各种组分不会丢失或失活，超微结构及机械特性无明显改变。因此，经消毒处理后SIS具有较高的安全性。同时Sarikaya A等［6］指出SIS浸出液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用，可以抑制细菌的生长。3、生物力学性能：小肠黏膜下层是一种非线性材料，在纵轴方向（无论是否刨开管壁）的抗拉伸强度相当于肌腱和韧带组织的1／7到1／4［7］。SIS作为体内组织工程的材料，具有适当的机械特性，能承受周围组织压力，为再生细胞提供足够的生长空间。

SIS因为其良好的生物学优势，已被广泛应用于基础研究及临床替代材料。Bejjani GK等［8］用SIS作为硬脊膜替代材料治疗了59例临床病人，其中包括Chiari畸形、脑部肿瘤患者术中需要修补硬脊膜者，术后随访仅1例并发脑脊液漏，2例并发感染。其余患者均恢复良好。SIS还被用于疝、肛瘘的修复，以及作为皮肤替代材料等。

作为组织工程学支架材料首先必须具备细胞相容性，由于研制的组织工程化组织最终的目的是要移植入生物体，因此必须能与生物系统相结合。支架材料的细胞相容性包括细胞在材料中的粘附、扩展、迁移、生长及功能特性。目前对SIS细胞相容性的研究非常多。

2 SIS与细胞相容性研究进展

2.1 SIS与骨髓基质干细胞（BMSC）相容性：张开刚等［9］用SIS与BMSC体外构建组织工程骨膜。在体外联合培养过程中用相差显微镜、扫描电镜及透射电镜观察，认为SIS本身所含有的活性生长因子可促进兔BMSC的分化、增殖。细胞培养7天后附着材料表面数量明显增多，10天后细胞连成一片，2周时细胞数量更多，细胞层数也更多。通过透射电镜观察，BMSC在SIS上细胞核成梭型或不规则型，内质网丰富、扩张，细胞基质致密。说明在SIS上的BMSC细胞活力强，但随着时间延长，底层细胞活力比上层减弱。王军胜等［10］通过用不同方法预湿SIS，证明胎牛血清预湿的SIS可以使兔BMSC较早的伸展完全粘附于SIS支架上。他们认为胎牛血清可以保护细胞、促进细胞粘附及增殖。

2.2 SIS与前脂肪细胞相容性：兰海等［11］取人脂肪组织消化后与SIS联合培养。通过MTT法检测。对照组细胞接种1天后进入快速增殖期，而材料组经过3天潜伏期后快速增殖，两组增殖速度接近，材料组比对照组晚6天进入平台期。认为SIS含有的细胞外基质成分促进人前脂肪细胞增殖，而且其空间结构也有利于细胞生长及粘附。

2.3 SIS与schwann细胞相容性：苏琰等［12］在体外复合培养SCs与SIS，通过组织学方法检测SCs在SIS支架上生长的情况，并通过SCs分泌神经生长因子（NGF2β）和脑源性神经营养因子（BDNF）量的多少来检测SCs的细胞活性。通过相差显微镜和扫描电镜观察，可见SCs在SIS表面能够良好地黏附，生长活跃，增殖旺盛；通过ELISA检测发现SCs与SIS复合培养后，其分泌NGF2β与BDNF的神经营养因子功能良好，与正常培养的SCs无显著性差异。通过这两方面的检测证明SCs与SIS相容性良好。卢洪凯等［13］将SCs与SIS体外复合培养后移植到CN神经损伤大鼠模型神经损伤处，术后3个月行阿朴吗啡试验及检测大鼠海绵体内nNOS表达，证明SCs与SIS复合移植物可以修复CN损伤。傅一山等［14］将SCs与SIS复合培养后移植修复大鼠损伤脊髓，术后4－12周进行形态学检查发现移植处炎性细胞浸润不明显，有大量再生的有髓神经轴突，无明显变性坏死和胶质瘢痕增生现象。

2.4 SIS与成骨细胞相容性：罗静聪等［15］利用人胚骨膜成骨细胞（HEPOB）与SIS体外培养，通过形态学检测，HEPOB24小时后在SIS周边粘附，随着时间延长细胞数量增多，融合成片，细胞计数均在5天时达最高值，而复合培养细胞计数5天时较3天时计数加倍率高于单纯培养组，说明SIS可促进HEPOB的增殖。

2.5 SIS与上皮细胞相容性：Gabouev AL等［16］在SIS上种植膀胱上皮细胞和膀胱平滑肌细胞，免疫组织化学染色显示，在SIS上形成了膀胱上皮细胞和膀胱平滑肌细胞双层结构，说明利用SIS可以成功地制成组织工程化的膀胱壁。Lindberg K等［17］将上皮细胞种植在SIS上，第2天上皮细胞即出现2～3层上皮样结构，10余日后SIS表面下出现小的成簇的上皮细胞，显现出分层的鳞状上皮样结构，组织学观察可见基本成熟的上皮结构，而且上皮细胞表现出优先迁入SIS的管状结构。谭波等［18］采用混合酶消化法，于6%胎牛血清的上皮细胞无血清培养基中培养犬空腔粘膜上皮细胞（OMECs），将第2代犬OMECs接种在SIS上，行苏木精－伊红染色、免疫组织化学染色、扫描电镜等观察OMECs在SIS上的生长状况。OMECs接种在SIS上呈单层生长，多角形，铺路石样排列，复合培养8天后呈多层生长。

2.6 SIS与胰岛细胞相容性：Woods EJ等［19］将纯化的胰岛细胞种植在SIS上，并给予糖刺激，根据放射免疫法检测显示，第2周末胰岛细胞表现出高胰岛素分泌，第3周末胰岛细胞与对照组相比，形态正常，胰岛素分泌量增加。用SIS作为支架材料对胰岛细胞进行移植，能够加强胰岛细胞在体外的功能和活性，是临床治疗糖尿病的新方法。

2.7 其它：杨志明等［15］体外培养人胚皮肤成纤维细胞（HESFB）与兔肾血管内皮细胞（RRVEC），并在体外与SIS复合培养。通过MTT法测定细胞增殖，用流式细胞仪检测复合培养细胞在不同培养时间的细胞周期、细胞凋亡。等到SIS对两种细胞的细胞周期及细胞凋亡均无影响。SIS与HESFB、RRVEC有良好的相容性。

3 结语

因为小肠粘膜下层本身为细胞外基质，经过处理后无免疫原性及毒性，但是含有许多有利于细胞粘附及生长的细胞因子，是一种理想的天然可降解组织工程学支架材料。现在SIS已经在基础及临床方面进行了大量研究，SIS在基础实验中与多种细胞在体外复合培养均显示SIS有良好的细胞相容性。但是现在主要是应用SIS本身所含有的细胞因子来促进细胞在SIS上粘附、增殖，只有个别学者［10］对SIS进行预处理后再与细胞复合培养。目前没有一种理想的预处理方式可以使细胞在SIS上更好的粘附、增殖，也没有文献报道过SIS上粘附细胞的具体数量。所以对于SIS的细胞相容性还需更多的关注及研究。

［1］张开刚，曾炳芳，张长青.骨髓基质干细胞复合小肠黏膜下层体外构建组织工程骨膜的实验研究［J］.中华外科杂志，2005.12：1594－1597

［2］王军胜，王栓科，高恩建，等.不同预湿方法对构建组织工程骨膜细胞黏附率的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复.2008.04.08：2806－2810

［3］兰海，黄富国，杨志明，等.前脂肪细胞在小肠黏膜下层的生长与增殖［J］.中国组织工程研究与临床康复.2010.06.18：4599－4602