新的生物标记物在脓毒症诊断中的价值

解立新

脓毒症是指由感染引起的全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，病情进展迅速，甚至在较短时间内继发多脏器功能障碍而危及患者生命，且具有发病率高、病死率高及治疗耗资巨大的特点。虽然近些年来医学科学有了很大的进步，但是，据世界卫生组织估计，脓毒症造成的总死亡人数仍会持续上升，全球每天约有1400 人死于脓毒症，高于急性心肌梗死、肺癌或乳腺癌致死人数。鉴于脓毒症具有病情发展快、进展迅速和病死率高的特点，寻找能够早期明确诊断、准确判断疾病严重程度和对疾病预后进行预判的临床生物标记物(Biomarkers)是临床医学的研究重点之一。

1 临床应用现状

目前，临床常用的生物标记物有白细胞(white blood cells，WBC)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反应蛋白(C-reaction protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)、白介素-6(interlukin-6，IL-6)等，对脓毒症患者的及时诊断和治疗发挥了重要作用。

1.1 白介素-6(Il-6) IL-6 主要由单核/巨噬细胞、T 淋巴细胞和纤维母细胞合成，可促进肝脏合成急性期蛋白，激活T 淋巴细胞，诱导B 淋巴细胞的终末期分化，成为具有分泌免疫球蛋白的免疫活性细胞，并具有多种生物学功能。在脓毒症的预后评估中发挥着重要作用。

1.2 C-反应蛋白(CRP) CRP 是由肝脏生成的血浆蛋白，会结合在死亡细胞或微生物外膜上的磷酸胆碱，以活化补体系统，当体内有急性炎性反应、细菌感染、组织的损伤时，CRP 在数小时内出现，而疾病治愈后又很快消失，是一种非特异的炎性反应标志物。CRP 并不适用于单一疾病的诊断，其临床价值主要在于组织损伤的筛检和监测。

1.3 降钙素原(PCT) PCT为一种糖蛋白，是降钙素(CT)的前体。正常情况下，血清PCT 的浓度极低，基本不能被检测出来，在感染等炎性反应刺激下，尤其是合并有严重菌血症、感染性休克时，PCT会明显升高，被认为是评价感染严重程度很有价值的生物标记物。

但是，在临床应用中发现，上述生物标记物远远没有起到预期的作用。笔者研究发现，WBC 和CRP在早期鉴别脓毒症和SIRS 方面没有优势，在动态评价疾病严重程度和预后上也不具有较好的临床价值［1，2］。PCT 虽然对疾病预后评价具有重要价值，但在脓毒症早期诊断方面没有优势，对脓毒症严重程度评估也不够理想［2-4］。Pierrakos 等［5］对用于脓毒症评估的生物标记物做了文献荟萃分析，发现虽然已有多种生物标记物用于临床检测，但主要用于预后评估，且由于在临床实践中缺乏足够的特异性或敏感性，用于脓毒症诊断的生物标记相对较少，在诊断脓毒症方面具有很好的敏感性和特异性的生物标记物尚未发现。因此，需要寻找新的生物标记物为临床服务。

2 新的生物标记物

2.1 髓系细胞表达触发受体-1 髓系细胞表达触发受体-1(TREM-1)是一种特异性表达髓系细胞的受体，按照所处位置不同，可分为膜结合型和可溶性(solubleTREM-1，sTREM-1)两种形式，由Bouchon 等于2000年发现。TREM 属于免疫球蛋白超家族受体，人的TREM 编码基因位于染色体6p21，与MHC II 区域相邻。人的TREM-1 表达于中性粒细胞和单核巨噬细胞，由含194个氨基酸残基的胞外域、29个氨基酸的跨膜域和5个氨基酸的胞浆域组成。跨膜区域的1个带正电荷的赖氨酸残基与接头蛋白DAP12 跨膜区带负电荷的天冬氨酸残基偶联，从而使ITAM 酪氨酸激酶残基磷酸化，通过激活ZAP70 和非受体型酪氨酸激酶(SYK)，引起细胞内Ca2+动员、肌动蛋白细胞骨架重构及多种转录因子活化，最终导致促炎因子的释放，放大宿主对微生物成分的应答，从而放大炎性反应。TREM-1的自然配体可能是直接的微生物成分，如脂多糖LPS，也可能是由感染和(或)组织坏死所产生并释放入血的内源性可溶性或膜结合型蛋白，在炎性反应链中具有重要作用，可介导多种促炎因子，如TNF-α、IL-1β 和GM-CSF 的产生，对脓毒症的发生发展具有重要作用。笔者研究发现，血清sTREM-1 在早期鉴别脓毒症和SIRS，对疾病严重程度评估和预后评价等方面均优于CRP、PCT［2］。尽管血清sTREM-1 对于鉴别诊断监护病房不明原因发热患者是否患菌血症的价值有限，但是其判断菌血症患者的预后具有较好的价值［6］。将血清sTREM-1 用于评价呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia，VAP)的研究提示，血清sTREM-1 +WBC+CPIS 评分联合诊断VAP 的效能最高［7］。此外，尿液sTREM-1 对早期急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的诊断甚至优于血清肌酐(serum creatinine，sCr)［8］。由于血清sTREM-1 对脓毒症诊断及其预后判断的重要价值，笔者检测了79例脓毒症患者和80例健康者TREM-1 基因的四个外显子上的SNP 变化，发现TREM-1 基因位点rs2234237 的变化与脓毒症的预后有关，并影响脓毒症患者的生存时间;如果患者的该位点发生变化，其患脓毒症后预后不良的概率会大大增高［9］。

2.2 清道夫受体CD163 人类CD163 是一种糖蛋白，是表达在巨噬细胞膜上唯一的血红蛋白受体。CD163 以两种形式存在，一种以膜结合型存在，膜结合形式经过蛋白酶切割后胞外区脱落入体液中形成另一种形式，即soluble CD163(sCD163)。在生理和病理情况下，红细胞破裂后释放到红细胞外的血红蛋白与结合珠蛋白结合，通过膜上的CD163 受体介导的内吞作用被单核-巨噬细胞吞噬。现有的研究证明，sCD163 是一种早期的急性时相蛋白，在机体初始的抗炎反应中可能具有重要作用。笔者发现，外周血sCD163 在早期鉴别脓毒症和对疾病预后评价方面优于CRP 和PCT，但是对疾病动态变化的评价价值有限［10-12］。笔者检测了脓毒症患者尿液sCD163 的水平，发现尿液sCD163 对诊断脓毒症、疾病严重程度评估和AKI 预判同样具有很好的临床应用价值［1，11］。笔者还对外周血sTREM-1、sCD163、PCT、CRP 和WBC进行了比较，发现sTREM-1 在脓毒症诊断和严重程度评价方面具有明显的优势，而sCD163 在动态评价疾病预后方面效果最佳。

2.3 新的外周血miRNA 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类内源性非编码的长度约22 nt 的小分子RNA，它能够在转录后水平通过介导mRNAs裂解或抑制翻译来调控mRNAs 的表达。研究证明，miRNAs 不仅参与宿主固有免疫反应的调控，还参与适应性免疫的调控，并且在抗感染方面也发挥着重要作用。现有的研究发现，血清中的miRNA 是抗核糖核酸酶和DNA 酶消化的，而且反复冻融、高或低的pH 环境对miRNA 均没有显著的影响，因此在不同患者中多次检测同一miRNA 的水平也体现其含量的可重复性和一致性。笔者发现，血清miR-223、miR-15a、miR-16、miR-193b*、miR-574-5p、miR-483-5p 和miR-297 可以用于脓毒症预后的评价，并且二分类变量logistic 回归分析发现，miR-193b* 的相对危险度高达9.23，高于常用指标APACHEⅡ评分和SOFA 评分。在这些预后相关的miRNAs 中，miR-15a 和miR-16 可以用来区分脓毒症和健康对照，而miR-15a 可以用来区分脓毒症患者和全身炎性反应综合征［3，4，13，14］。对笔者上述验证得到的脓毒症相关的miRNAs 进行靶基因预测和靶基因通路注释，得到5个脓毒症相关的靶基因。笔者测定了这些靶基因编码蛋白在脓毒症患者血清中的表达量发现，其中的4个蛋白在生存患者和死亡患者血清中有差异表达。动态分析发现ACVR2A 和FOXO1 可以作为脓毒症患者的血清标记物。既往研究也发现FOXO1 是miR-223 的靶基因［15］。这说明，不仅血清miRNAs 可以作为脓毒症患者的血清标记物，这些miRNAs 靶基因的编码蛋白也可以作为标记物。

2.4 蛋白质组学与代谢组学的研究 两研究都是翻译后水平的研究，是发挥生物学功能的最终阶段。肾脏在脓毒症的发生过程中极易受累，这已被越来越多的临床和基础研究证实。在脓毒症发生时，血流动力学的变化会使肾小球滤过率降低;肾脏局部炎性反应和免疫反应，以及毒性损伤会导致细胞损伤和滤过屏障功能破坏，这些因素最终可发生肾脏功能损伤或者衰竭［16，17］。因此，尿液成为一种很好的生物样本研究材料，其中的某些蛋白分子有可能成为潜在的生物学标志物，而且这种无创性的检查可以提高检测准确度，减少患者痛苦并节省医疗费用。笔者通过iTRAQ 蛋白组学技术发现，当发生脓毒症时，患者尿液中的血红蛋白、钙黏蛋白-1、铜蓝蛋白、补体C3、α1抗胰蛋白酶会发生显著的改变;而硒约束蛋白、硫酸肝素蛋白多糖、载脂蛋白、血红蛋白、α1-B 糖蛋白、溶酶体相关膜蛋白-1、二肽基肽酶能够提示脓毒症的不良预后，并通过Western Blot 技术验证了患者早期溶酶体相关膜蛋白-1 的显著减低可能提示预后不良［18，19］。

代谢组学方法为探讨脓毒症的生物标志物和相关机制提供了一个新的视野。笔者研究结果提示，脓毒症的代谢紊乱十分复杂，涉及氨基酸水平、肉碱和酰胺类浓度、甘油磷脂及花生四烯酸类代谢水平明显的异常。半胱氨酸随着脓毒症的加重而逐渐减低，能够反映了脓毒症疾病的严重程度，并揭示了脓毒症发病过程中氧化损伤和炎性反应加剧的机制。同时，从代谢动力学来看，丙烯酰肉碱贯穿在脓毒症发生发展的始终，提示其可能是一种潜在的生物学标志物。

2.5 贯穿组学技术 随着高通量技术的发展和系统生物学理论的不断完善，人们越来越认识到不能单单从一个组学的角度去解释一个复杂的生物学现象和本质。因此，如何将基因组、转录组、蛋白组、代谢组的数据进行整合成为贯穿组学，以解释功能和发病机制，成为了目前研究的前沿问题。但是，进行相关研究并非是对高尖技术的简单套用，应根据疾病的特点、病理类型、临床分期等，因病制宜地选择相应的技术手段，去解释高通量所带来的海量数据。如果能将这些技术充分应用并相互结合和补充，必将进一步阐明脓毒症发生发展的分子机制。理论上讲，通过脓毒症的多组学多层次贯穿研究，能够对脓毒症的理论和临床研究寻找到新的发现和新的思路。

2.6 T 细胞免疫球蛋白与黏蛋白-3(T cell Ig and mucin domain protein 3，Tim-3) 是Tim 家族中的一员，最初在分泌IFN-γ 的CD4+T 淋巴细胞的Th1 亚群和CD8+的Tc1 细胞表面被发现［20，21］，通过与其配体Gal-9 结合，Tim-3 可诱导T 细胞凋亡和免疫耐受。另外，Tim-3 还表达于巨噬细胞和树突状细胞等天然免疫细胞表面并参与了天然免疫反应的调节［22］。近期研究发现，在脓毒症的发病过程中，Tim-3 通过下调TLR 的应答来抑制巨噬细胞的过度活化，中和Tim-3 后，机体巨噬细胞的活性增强，脓毒症的病情加重，提示Tim-3 作为一种新型免疫稳态调节分子参与了脓毒症抗炎与促炎平衡的调节［23］。笔者检测了脓毒症不同病情严重程度下外周血单核细胞膜表面的Tim-3 水平，发现Tim-3 的表达量对于脓毒症病情严重程度的评估优于CRP、APACHEⅡ评分和SOFA 评分，而在评估患者预后方面的价值稍差。Tim-3 在脓毒症患者外周血单核细胞膜表面的低表达提示病情严重，预后不良。目前对于Tim-3 的后续研究仍在进行中。

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