肝癌细胞免疫治疗进展

杨 帆(综述)，张 琪陈规划(审校)

1.中山大学附属第三医院岭南医院生物治疗中心，广州 510630;2.肝脏疾病生物治疗临床转化广东普通高校重点实验室，广州 510630;3.中山大学附属第三医院肝脏外科，广州 510630

原发性肝细胞癌(肝癌，hepatocellular cell carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，目前主要治疗方法有手术治疗、放疗、化疗及综合治疗等。由于肝癌起病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，确诊时已达晚期或发生远处转移，即使是手术切除后也容易复发，缺乏有效的治疗药物和手段，总的治疗效果并不理想。生物治疗作为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四种模式，已显示出了良好的应用前景。目前生物治疗主要包括肿瘤非特异性小分子化合物免疫治疗、过继免疫治疗、肿瘤疫苗治疗、肿瘤单克隆抗体的免疫治疗、分子靶向治疗和基因治疗等［2］。细胞免疫治疗是指根据免疫学原理，利用细胞治疗肝癌，它是生物治疗的重要组成部分，受到越来越多的关注。细胞免疫治疗按其作用机制又分为两类:(1)给患者回输经过体外激活和扩增至一定数量后具有内在抗肿瘤活性的自体免疫细胞，在体内发挥杀伤肿瘤，ACT 的治疗方法属于被动细胞免疫治疗;(2)给患者回输能在体内激发患者的特异性抗肿瘤免疫反应的细胞如回输树突状细胞的树突状细胞，属于主动细胞免疫治疗。本文就肝癌常用的细胞免疫治疗研究现状和进展作一概述。

1 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)

CIK 细胞是人单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞，流式细胞仪进行免疫表型分析发现CD3+细胞、CD8+细胞较多，尤其是CD3+CD56+T 淋巴细胞。CIK 细胞同时具有T细胞和NK 细胞的标志［3］。Schmidt-Wolf［4］实验证明，CIK 细胞起源于CD3+T 细胞而非CD56+NK 细胞。该细胞群是在多种细胞因子如IL-2、IFN-γ 及某些单克隆抗体(Anti-CD3McAb)的刺激下，由从外周血、骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非MHC 限制的、极强的溶瘤活性［5］。由于CIK 细胞具有高增殖能力和高细胞毒力且对正常骨髓细胞抑制轻微，可用于恶性肿瘤的细胞过继免疫治疗和自体造血干细胞移植时微小残留病的净化。

Huang 等［6］比较CIK 联合经导管肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)及射频消融(radiofrequency ablation，RFA)，与单独序贯使用TACE 及RFA 对于肝癌的治疗效果，HCC患者分为两组，85 名患者接受TACE +RFA +CIK联合治疗，89 名患者接受TACE +RFA 治疗，总体有效率分别为76.5%及79.8%。疾病控制率分别是95.3%及88.8%，结果并没有显著的差异，然而Kaplan-Meier 分析显示TACE +RFA +CIK 组比起TACE+RFA 组有更长的生存期(分别是56个月及31个月，P=0.001)，CIK 细胞治疗组患者没有发生严重的副作用。因此，作者认为CIK 细胞治疗是HCC 患者TACE 及RFA 之后防治肝癌复发和转移的一项重要的治疗手段，它能够有效地提高患者的生活质量。Cui 等［7］对比了HCC 患者RFA 治疗及联合使用CIK 治疗，同样提示CIK 治疗是一种安全有效的治疗方式，能够防止RFA 治疗后HCC 的复发。Ma 等［8］为了探讨CIK 对于肝癌患者的作用，对一系列CIK 随机的临床Ⅱ、Ⅲ期试验利用肝癌和CIK 细胞作为关键词进行检索，分析结果表明CIK细胞治疗对于肝癌有明显的生存受益，对比CIK 及未进行CIK 组，CIK 治疗组显示出更长的无疾病进展生存，更好的疾病控制率和总反应率;同时CIK治疗组病人显示出更好的生活质量，HBV-DNA 的病毒载量及AFP 水平有明显下降，另外对比了周围血T 淋巴细胞的亚型，发现CD3+、CD4+、CD4+CD8+及CD3+CD4+T 细胞均高于未进行CIK 细胞治疗组。

2 肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)

1986年Rosenberg 等［9］描述了一类从肿瘤组织中分离出来的具有杀肿瘤细胞特性的淋巴细胞，为CD3+CD56－CD8+的免疫表型，具有抗癌活性的T 淋巴细胞，并命名为肿瘤浸润淋巴细胞。TIL 细胞是从手术切下肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中获得淋巴细胞，经加IL-2 培养后，具有高效、特异、副作用小等优点，对肿瘤细胞的杀伤有MHC 限制性，杀伤活性较淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells，LAK 细胞)强［10］。国内外学者一系列研究表明HCC 患者TIL 浸润的预后明显优于没有明显TIL 浸润［11］。HCC 术后易于复发，为了探讨术后的TIL 免疫治疗是否降低癌症的复发，Takayama T 等［12］通过对150 名手术切除HCC 患者进行过继免疫治疗，研究结果表明免疫治疗明显延长患者的生存期，同时减少HCC 复发。

提高TIL 杀伤功能的方法主要通过对T 细胞进行改造，具体方法有如下两种。第一种方法是利用转基因技术对T 细胞进行改造，克隆抗原特异性TCR 基因，通过病毒转染使其在T 细胞表面高表达，改变抗原特异性T 细胞受体的α 及β 链，可有效提高其识别和杀伤肿瘤细胞的能力。Gehring等［13］为了研究是否TCR 基因的改变能够重新建立慢性HBV 患者的特异性的T 细胞免疫，同时探讨HBV-DNA 整合的HCC 细胞能否被基因改造的T细胞识别。应用载体介导的，HBV 特异性的TCR插入到T 细胞表面，研究结果表明经过改造的T 细胞能够靶向杀伤HBV 相关性HCC。由于利用病毒载体来插入外源性的HBV 特异性的TCR 到T 细胞在临床试验中比较复杂且昂贵，同时对于HBV 持续感染的患者有插入突变及潜在毒性的风险。Koh等［14］研发出一种更加安全实用的方法来治疗HCC，他们利用电转染编码抗HBV 的TCR 的mRNA，24 h 后，80%的CD8+T 细胞表达出HBV 的TCR，表达的效率明显高于通过逆转录病毒转导(18%)。在HCC 异种移植物模型中，TCR 电转的T 细胞有效的防止肿瘤的增殖及抑制肿瘤的生长。

第二种方法为嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰TCR，将T 细胞表面TCR 改造为CAR。CAR 技术的基本原理是通过基因工程技术将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体(scFv)和T 细胞的活化序列在体外进行基因重组，形成重组质粒，在体外通过转染技术，转染经纯化与大规模扩增后的T 细胞，称之为CAR-T 细胞，使淋巴细胞能通过非MHC 限制性的方式识别特定抗原，增强其识别和杀伤肿瘤的能力。CAR 的基本骨架包括胞外区、跨膜区和胞内区3 部分，胞外区主要是单克隆抗体的单链可变区序列(scFv)，抑或激素的信号肽细胞因子膜受体的胞外区等;胞内区为信号转导部分，主要是T 细胞受体(TCR)/CD3 的链免疫球蛋白Fc 受体Fc R I 的链或CD3-链;而跨膜区可来源于同一分子或为1 型跨膜蛋白，如CD4，CD8 或CD28［15］。随着技术的不断改进，CAR 现已有三代，第一代CAR 并不能延长T 细胞的生存时间;第二代CAR 增加了共刺激信号如CD28、CD137(41-BB)、CD134(OX40)、ICOS 等，以刺激T 细胞的增殖，体内外实验表明第二代CAR-T 细胞的功能较第一代明显增强;第三代CAR 整合了2个以上的共刺激分子以期望能进一步增强T 细胞的活化［16，17］为了研究表达有乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)特异性受体的T 细胞能否直接杀伤HBV 病毒，将CD8+T 细胞表面TCR 改造成连有HBV 膜蛋白嵌合抗原受体，并将改造后的CD8+细胞回输HBV 感染小鼠，发现能够很好地抑制HBV 的复制，同时对于小鼠肝脏的损伤小，这种CAR 改造的T细胞能够不仅仅能有效清除HBV，同时有助于防止肝癌的进展。

3 自然杀伤(natural killer，NK)细胞

NK 是细胞瑞典免疫学家Kiessling 在20 世纪70年代发现的一类大颗粒淋巴细胞，它是天然免疫的主要细胞，具有抗肿瘤，抗感染和免疫调节等功能。人的NK 细胞是CD3－CD56+淋巴细胞。目前有关NK 细胞在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在自体NK 细胞过继免疫治疗、异体NK 细胞过继免疫治疗及基因修饰NK 细胞免疫治疗等［18］。

自体NK 细胞输注安全，对治疗肿瘤也取得了一定的疗效，但NK 细胞短期活化对细胞表型和功能的恢复不够，自体NK 细胞输注要发挥临床作用可能需要长期的体外活化，发现长期活化NK 细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性明显高于短期活化，应进一步完善与提高NK 细胞体外活化和扩增技术［19］。异体NK 细胞过继免疫治疗是NK 细胞来源于异体脐带血、NK 细胞系或异体去淋巴细胞液在体外分离出NK 细胞并扩增培养。异体NK 细胞，有利于杀伤表达有自身MHCI 分子的肿瘤细胞，同时为了防止移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)发生，供体一般要预先把T 淋巴细胞去除，仅留下NK 细胞［20］。基因修饰NK 细胞免疫治疗就是利用分子生物学技术对NK 细胞进行改造，增强其杀伤肿瘤的功能。Jiang 等［21］利用电转化技术将IFN-α 基因转入NK 细胞系中，并观察在体内外经过IFN-α 修饰的NK 细胞对于HCC 的效应，结果表明经过修饰过的NK 细胞中细胞毒性相关的一些基因如穿孔素、粒酶B、Fas 配体上调。细胞分泌的TNF-α 及IFN-γ 能够增加Fas 的表达以攻击HCC 细胞，同时增加NK 细胞介导的HCC 细胞溶解作用，在异种移植瘤模型中IFN-α 修饰的NK 细胞能够有效的延长种植有HCC 移植瘤裸鼠的生存期。因此，作者认为IFN-α 修饰的NK 细胞能有望成为将来肝癌免疫治疗的重要方法。

4 树突状细胞(dendritic cell，DC)

DC 疫苗是瘤细胞或与瘤细胞融合产物，或采用肽疫苗，即分离纯化膜表面抗原肽或人工合成的肽，与正常人的DC 或患者自身DC 体外共培养，再回输至患者体内，重新让DC 有效激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)介导的免疫反应。可提高荷瘤宿主免疫效应细胞对肿瘤细胞的毒性，诱发宿主对肿瘤特异抗原的特异性免疫应答。

DC 能直接活化CD4+、CD8+T 淋巴细胞，产生抗原特异性细胞及体液免疫应答反应。DC 具有非特异性免疫效应功能，可杀伤多种新鲜分离或培养的肿瘤细胞。DC 作为功能最强的抗原呈递细胞，是机体免疫反应的始动者，因此，在以DC 为基础的治疗方案中，DC 的抗原递呈是T、B 细胞发挥免疫反应的先决条件，借助DC 高表达的主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ类分子所递呈的肿瘤抗原肽，联合CD80、B86、CD40 分子共同作用，充分激活T 细胞。初始型T 细胞接受DC 递呈的抗原后活化并增殖，促进其在肿瘤部位聚集以执行免疫功能［22］。DC 为基础的细胞治疗属于肿瘤疫苗治疗，由于疫苗治疗具有特异性、在体内免疫效应维持时间长等优点，目前已成为研究热点。DC 疫苗在细胞治疗中起着重要作用，近年来DC 疫苗在肝癌治疗中显示出良好的应用前景。

Palmer 等［23］进行一项Ⅱ期临床试验来评价静脉输入自体经过肝癌细胞系(HepG2)刺激成熟的树突状细胞对于进展性HCC 的安全及有效性。研究结果表明134例DC 回输患者中没有发现有明显毒性，同时对25例进行了3 次以上治疗的患者进行临床评价，放射学的基本控制率为28%，其中17例患者血浆AFP ＞1000 ng/ml，经过治疗后AFP 降到小于30% 的基线水平，其中1例患者AFP 小于10%基线水平。因此，从放射学及血清学均说明树突状细胞疫苗对于肝癌是一种安全及可耐受的抗肿瘤治疗。El Ansary 等［24］等对于30例无法接受放射治疗及局部治疗的患者，15例患者接受肝癌细胞系的裂解产物负载的DC 疫苗治疗，15例患者接受一般支持治疗。结果表明接受疫苗治疗患者的总体生存期提高了，同样说明了DC 疫苗对于肝癌是安全可耐受的肿瘤治疗方式。Tada 等［25］为了评价肿瘤相关抗原负载的DC 对HCC 的安全，可行及有效，α-甲胎蛋白、glypican-3 及MGGE-1 重组蛋白负载DC 成熟，DC 于腹股沟淋巴结皮下注射，结果表明对于5 名试验者是安全可耐受的，并且都能对肿瘤相关抗原产生T 细胞反应。

5 展望

肝癌治疗由单一治疗发展到综合治疗是大势所趋，免疫细胞治疗配合手术切除、介入治疗、射频治疗等常规肝癌治疗手段，有利于提高肝癌患者生活质量，减少复发率，延长生存期。随着细胞治疗技术不断改进，细胞免疫治疗将充分发挥其疗效好、不良反应小的优点，在肝癌治疗中将起到愈来愈重要的作用。

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