药物靶点筛选的研究

崔大明

长春中医药大学，吉林长春 130117

20世纪90年代，随着生命科学的发展和生物技术的进步, 基于靶点的药物发现模式逐渐取代了传统的基于药物化学结构的发现模式，成为现代创新药物研发的主流模式。本文主要总结了药物靶点筛选的全部流程，并重点介绍了靶点确认及验证的成熟方法。

1 药物靶点筛选的三个阶段

1.1 小分子药物的筛选

药物靶点的筛选首先要筛选感兴趣的药物，主要有两种基本方式：基于靶点的筛选和表型筛选。

1.1.1 基于靶点的筛选 到目前为止，很多药物都是通过这种方法筛选得到的，基于靶点的筛选可以有效的筛选到具有生物活性的小分子物质，这种筛选方式定位于特定的靶蛋白，例如，激酶，组蛋白去乙酰化酶或者是G蛋白偶联受体。通过此方法筛选得到的小分子活性物质对靶点的具有强烈的影响作用，但是，在有机体内，它可能影响多种蛋白及信号通路而不仅仅是一个靶点或通路。在活体内，一种蛋白的功能通过与另一种蛋白的相互作用而发挥，同样的，小分子物质因为其化学性质及与细胞内信号机制的固有连通性，因而具有多个靶点。所以，要想明确了解某个已选定的小分子物质的活性，需要一个更综合的行筛选方法例如表型筛选法。

1.1.2 表型筛选法 表型筛选法是一种综合性的筛选方法，可以在细胞或者是生物体水平上评估某个小分子物质的生物活性。

血管新生筛选包括细胞入侵和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成血管，当用血管内皮细胞生长因子或者低氧的环境处理时，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）侵入到基质中重建新的血管，而人脐静脉内皮细胞（HUVECs）也可以形成管状结构来稳定新生的血管。如果某个小分子物质抑制以上两种现象且同样抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的生长，那此物质就是一种潜在的血管生长抑制剂。

自噬筛选包括对增多的自噬体的检测[5]，通过酸性胞液染色标记可以很容易的检测到自噬体的存在，高内涵筛选（HCS）可以量化活细胞内自噬体的数目。此外，细胞的形态学特征，生长状况及死亡情况都可以很容易的检测到，自噬可以作为治疗癌症及动脉粥样硬化的潜在靶点。自噬电离剂（Autophagonizer），是近几年通过表型筛选及后期的高内涵筛选（HCS）得到的一种诱导细胞自我吞噬的小分子物质，且它不会被部分已知的自噬抑制剂所抑制，它的作用机制似乎与雷帕霉素有所不同，雷帕霉素是通过抑制雷帕霉素靶蛋白诱导细胞的自我吞噬，但是其作用靶点还有待研究。

表型筛选相对于传统的基于靶点筛选具有以下几点优势：①表型筛选是对全基因组的筛选，覆盖了所有与所筛选表型有关的靶点及信号通路[6]。②表型筛选是在有机体及细胞水平下进行的，吸收，分配，代谢，排泄因素都考虑在内，但是经此方法筛选后，对于药物作用的靶点及通路是不明确的，需要后期进一步的识别和验证。③与传统的基于靶点的筛选相比，它不需要预先的假设及分析，这种筛选非常适合对机制不明的疾病的靶点的筛选。

2 靶点验证

多种靶点识别方法得到的药物作用靶点只能作为靶点初步筛选的方法，之后需要对候选靶点进行验证。第一步就是确认此靶点在细胞实验中是否调节化合物的生物活性。可以通过RNA干扰技术沉默某一疾病的基因，形成缺乏特定靶标的小鼠，看它是否具有普通小鼠药物作用后的症状，或者将药物注射到基因敲出的小鼠中，若药物没有引起效应，说明药物是通过这一特定靶点作用的，因为候选靶点的同系物也要被纳入考虑范围即使其在最初的筛选中并没有被识别，此外，一个物质可能具有功能性获得的活性，靶点的缺失会抑制此物质的活性[15]。除了RNA干扰技术，也可以用cDNA过表达来建立药物-靶点作用关系，这种方法类似于酵母中的拷贝数抑制现象，靶点的过表达可能会抑制药物的活性。这种方法对于验证膜靶点极为重要。

一旦假定的靶点通过功能实验的验证，就需要对小分子物质及靶点的亲和力进行量化。这一过程可以通过表面等离子共振或者等温量热法技术完成，如果假定的靶点是一种酶，则要通过酶动力学实验衡量此物质的酶活力[16-17]。最后，需要通过NMR或共结晶实验进行更为严格的验证，进而得到药物-靶点复合物的三维结构。这些信息不仅可以验证物理上的关联性，也可以提供后期药物优化中结合模型的鉴定标准。

3 结语

与传统的基于靶点的筛选方法相比，表型筛选是一种筛选具有高潜力药物靶点的快速有效方法。表型筛选是对全基因组的筛选，覆盖了所有与所筛选表型有关的靶点及信号通路，吸收，分配，代谢，排泄因素都考虑在内。这种筛选非常适合对机制不明的疾病的靶点的筛选。此方法筛选后，对于药物作用的靶点及通路依然是不明确的，需要经过后期对靶点的识别和验证。

经过表型筛选后，需要通过表型筛选呈阳性的物质识别细胞内的靶点，目前已经有多种成熟的技术方法用于靶点的识别，也不断有新的方法被广大研究人员发现，并取得了较好的效果，随着各项检测技术的发展，这些方法也在不断完善中，相信在不久的将来会有一套完整的靶点识别方法。

靶点识别得到的候选靶点并不一定就是目标靶点，其中可能混有假阳性结果，靶点验证就是对候选靶点的进一步筛选过程，并最终得到药物-靶点结合复合物的三维结构，这种结构对后期的药物优化工作具有很大的帮助。

药物靶点研究将对药物的发现和开发具有极其重要的促进作用，人们对药物靶点的研究将长期进行。随着对药物靶点认识的不断提高，技术方法不断成熟，新的药物靶点将不断发现，具有新型作用靶点、治疗疾病效果更好的药物也将不断出现。

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