10例皮肤病患者应用分子生物学技术对病原真菌感染诊断与应用

李宝坤

辽宁中医药大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁沈阳 110847

在最近几年，随着医学技术的不断进步，抑制免疫类的药物被广泛的应用。病原真菌感染的疾病在不断增多，所以菌种在临床诊断和治疗中也是非常重要的。真菌感染的诊断，可以以形态学为主要依据，但这些方法费时费力，并且检测率比较低。随着目前迅速发展的生物学技术，病原真菌生物学的特性越研究越深，本文对生物学技术对病原真菌感染诊断进行了分析和研究。随着生命科学和滑雪的不断发展，人们对生物体的研究进入到更深的层次，从当个的生物体发展到器官在到组织等。从细胞结果到核酸和蛋白的分子，到细胞结果到蛋白的分子水平，人们也逐渐认识到可以通过检测分子水平的线性结果来比较不同物种，或者同种物种不同个体之间的差异。这也为生物学和医学的每个领域提供一个更好的研究平台，一般分子生物学技术研究有以下几种：PCR、分子克隆、核酸电泳、琼脂糖凝胶电泳、测序DNA、RNA 提取、转化外源DNA、体外转录、逆转录、cDNA文库构建、原位杂交、酵母双杂交、差减杂交、扣除杂交，蓝白斑筛选、抗生素筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

真菌菌种，真菌菌种分为标准株与实验株，抽取念珠菌、烟曲霉菌，克柔念珠菌、新生银球菌近视分离实验。细菌菌株：大肠埃希氏菌、铜绿假单细胞菌、黄金色葡萄球菌，实验株，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌、肠球菌，通过实验室对其标本进行分离鉴定。

培养基：SDA

缓冲液：抽取DNA缓冲液、电泳缓冲液、10%SDS、电泳点样缓冲液。

分子量标记： DNA/EcoRI+Hind（0.5pg/pl），由上海华美生物工程有限公司提供。

酶及PCR反应体系

Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液等。

1.2 实验方法

将在人体内抽取到的真菌基因进行DNA制备：实验菌种接种与SDA器皿中，在28℃的温度下培养一周，用牙签刮去菌丝体，入到离心管中，进行称重，DNA采用酚氯仿进行纯化，将DNA与溴酚蓝缓冲液进行混合，点样与0.8%琼脂凝胶。

菌株基因组的DNA引物PCR：模板的DNA准备，提取DNA在分光光度仪的1000分广度上测定波长为260纳米的OD值，以1XTE进行稀释。

引物准备：对引物进行准备，1 0D+379ulddh2o稀释至浓度为10uM。

PCR起始反应：起始变性，温度在94℃以上，5 min，变形温度为94℃，1 min，退火47℃，1 min。延伸72℃，1 min，38个循环，72℃延伸5 min。

PCR加样顺序，在0.5 mg的量管中，需要加入ddH2o，在加入PCR buffer、dNTP、引物、模板和聚合酶。在同一引物中，不同模板的PCR反应是不同的，可以按照上述的加样顺序，按照一定比例加入到母管中，分装入到不同的模板中。对PCR产物进行保存，产物可以暂存于4℃，若是需要存储，在要冷冻与零下20℃。

电泳：配制1.2%的琼脂糖凝胶，凝胶中缴入EB溶液，浓度达到要求。点样：取一定量的PCR产物，与溴酚蓝缓冲液缓和，加入点样孔中，在紫外透射下照相。

2 结果

2.1 DNA抽取结果

在检验的过程中，丝状真菌DNA片顿大小都是在21KB以上，电泳凝胶上的溴酚蓝没有出现RNA模糊亮团的情况。用DNA试剂盒法，以便能够提取酵母菌中的DNA，观察可发现大小均在21KB以上，呈带状，片段保存比较完整。

2.2 引物PCR的分析

在电泳凝胶上，可以观察到卫星引物和随机引物，并且能够很好的观察到一些常见的皮肤菌类，致病念珠菌，可以和常见的酵母菌区分开来。在实验中不难发现，引物PCR的方法很稳定，对于区别皮肤菌类和非皮肤菌类都有很好的效果，现实的条带差别比较明显和直观。

3 讨论

病原真菌感染是皮肤常见的多发病和常见症。其中发病的位置都会在手癣、体癣、手足癣等一些浅表念珠菌病。真菌感染主要以皮肤癣菌和非皮肤癣菌为主。病原真菌的发病范围比较广，复发率也比较高。根据调查，在2011年和2012年中华医学会的皮肤病调查显示，在皮肤科门诊的患者中，足癣发病率高达45%和42%，甲真菌病的发病率达到15%，就个人来讲，病原真菌在很大程度上影响患者的生活质量。目前对于病原真菌的治疗有很多治疗方法，有很多新的广谱药物，都有不同抗菌谱。有些皮肤使用新的药物来控制癣菌，但有的药物控制的副作用比较大，会出现不同的抑菌浓度。

最近几年，人类真菌感染的发生率也在不断上升，而这些问题也会引起很多医学研究者的注意。传统对真菌分子生物学检测的方法是形状学检测和分离培养等步骤，传统的方法费用较高，浪费大量的时间，敏感度低，而且特异性也比较低。PCR是一种真菌分子生物学检测技术，主要用于方法特定某个部分的DNA片段。PCR方法的问世，也使得分子生物学检测技术得到了迅速的发展。PCR的体外酶促方法，也可以扩增位于两端的序列DNA。而对于PCR的改进技术，需要针对敏感性和特异性来操作。PCR的方法已经渗透到各个领域中，并且应用于真菌的治疗中。根据真菌的序列设计通用引物，使用PCR的方法扩增来判定感染真菌的种类和特异性的引物。有的会选用靶基因，并且亚基序列比较保守，应用于真菌通用引物比较方便，比较成熟的引物有NS1、NS3等等。有的研究学者表明，采用荧光标记引物扩增特异性ITS，结果能够证明，获得血液和组织的致病性在真菌种水平上的区分效果。也有研究者用多重PCR测定法来进行鉴定口腔念珠菌，采用CA4、ITS1等等进行检测。经过检测，所有的菌种检测都要比培养法准确得多，也就说多重PCR也是一种快速的检测方法。

对于传统的分子生物技术检测的方法比较复杂，观察容易出现误差、分型粗糙、因变异所导致出现重复性差的缺点，所以对分子水平进行分类检测也是必须的。病原真菌感染在传统的分类中，主要依靠体内的培养形态和生理生化特征和免疫学等方法。这种方法也比较繁琐，并且主观性强、周期长、重复性，并且也受到环境因素的影响，在分类能力和稳定性上受到一定的限制。按照一定的标准对DNA的杂交检测测定染色体序列。从基因的分型中显示其优点和特点。而最近发展起来的，脉冲电场凝胶电泳的技术，已经被充分应用在生物基因的分析和鉴定。

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