黄粉虫纤溶酶的三维结构模拟与序列分析

余 磊，韩雅莉

（1．武汉软件工程职业学院，湖北 武汉430205；2．广东工业大学，广东 广州510006）

黄粉虫（Tenebrio molitor）俗称黄粉甲、面包虫，原产于南美洲，属于仓库和贮藏害虫。因其营养成分高，营养含量居各类活体动物蛋白饲料之首，被誉为“蛋白质饲料宝库”。作者所在课题组从黄粉虫体内分离纯化得到黄粉虫纤溶酶［1，2］，对其基因DNA序列进行了分析，克隆得到其中一种黄粉虫纤溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登录号：JN662461），并将其表达［3］。在此，利用生物信息学方法，对黄粉虫纤溶酶序列进行多方位分析、确定活性中心的位置，建立了可靠的黄粉虫纤溶酶三维结构模型，并揭示了黄粉虫纤溶酶的纤溶机理。

1 方法

要想了解蛋白质的立体结构，需要将蛋白质溶液结晶，用X－射线衍射分析蛋白质的单晶才能完成。但是蛋白质结晶条件苛刻，而且不是所有蛋白质都能形成单晶，因此实施起来受到限制。利用现代计算机技术，人们可以对已知氨基酸序列的蛋白质三维结构进行预测，同时还能对蛋白质序列中的每一个氨基酸逐个分析。因此，比较蛋白质模建，又称同源模建，逐渐成为目前应用最广的蛋白质三维结构预测方法［4－6］。

将黄粉虫纤溶酶的序列提交到NCBI的自动比较蛋白质模建服务器Blast上，通过程序，自动确定黄粉虫纤溶酶序列活性中心与底物结合部位；将黄粉虫纤溶酶蛋白质序列导入Biosun软件，软件自动选取蛋白质Tryp＿SPc［cd00190］为模板，模拟得到黄粉虫纤溶酶的三维结构，并利用Blast比较模板蛋白与黄粉虫纤溶酶的同源性；利用Goldkey软件，对黄粉虫纤溶酶全序列等电点、亲水性、柔性进行分析，基于无模型比对时活性中心氨基酸残基的性质，进一步阐明黄粉虫纤溶酶的纤溶机理。

2 结果与讨论

2．1 黄粉虫纤溶酶序列分析（图1）

图1 黄粉虫纤溶酶序列分析Fig．1 The sequence analysis of fibrinolysin fromTenebrio molitor

由图1可知，黄粉虫纤溶酶序列的活性中心（Active sites）为 H72、D117、S212，底物结合部位（Substrate binding sites）为：D207、S228、G230。

2．2 三维结构模拟与评估

黄粉虫纤溶酶的模拟三维结构见图2，模板蛋白和黄粉虫纤溶酶的同源性比较见表1。

图2 黄粉虫纤溶酶模拟三维结构Fig．2 The analogous 3D－structure of fibrinolysin from Tenebrio moliter

图2中，a、b、c 3个球状模型，分别对应黄粉虫纤溶酶的活性中心S212、H72、D117三个氨基酸残基侧链：羟基、咪唑基、羧基，与胰蛋白酶催化三联体结构一致［7，8］。d、e、f三处肽键链状模型，分别对应黄粉虫纤溶酶的底物结合部位D207、S228、G230。由三维结构可以看出底物结合部位和活性中心均没有α－螺旋和β－折叠（α－螺旋为柱状区，β－折叠为板状区），该区域容易发生形变，在催化过程中与底物结合时，产生诱导契合，符合酶催化理论；酶活中心处于蛋白质中心凹穴处，与通常对纤溶酶活性中心的认识一致［9，10］。本课题组前期研究中曾发现黄粉虫纤溶酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的抑制，推测其为丝氨酸蛋白酶［2，3］，此推测与生物信息学方法找到的活性中心S212相吻合。

黄粉虫纤溶酶的序列为：MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPA－LRSYIQQTAGI。

模板蛋白序列为：IVGGSEAKIGSFPWQVSLQYTGGRHFCGGSLISPRWVLTAAHCVYSSAPSNYTVRLGSHDLSSNEGGGQVIKVKKVIVHPNYNPSTYDNDIALLKLKRPVTLSDNVRPICLPSSGYNLPAGTTCTVSGWGRTSEGGPLPDVLQEVNVPIVSNAECKRAYSYGGTITDNMLCAGGLEGGKDACQGDSGGPLVCNDNGRGVLVGIVSWGSGCARPNYPGVYTRVSSYLDWIQKT。

表1 模板蛋白和目的蛋白同源性比较Tab．1 The homology comparison between the template protein and the target protein

由表1可知，Blast评分为186，说明模板蛋白和目的蛋白的同源性比较高；序列覆盖率达到了94%；随机匹配的可能性非常小，仅为2E－62，说明两个蛋白出现相同的序列并非偶然；最大序列的相似度达到51%。表明，以此模板蛋白进行同源模建，所得结构是比较可信的。

2．3 Goldkey软件的序列分析

在黄粉虫纤溶酶三维结构分析中，采用的是同源模建的方法。预测过程中，其它蛋白质与目标预测物的差异，会导致一定程度的偏差。采用Goldkey软件对序列的每个残基逐个计算其特性，虽然无法得到三维结构，但是其数据可靠性更好，更能反映目标蛋白质的特性。用Goldkey软件分别对黄粉虫纤溶酶氨基酸序列进行等电点模拟、亲水性模拟、柔性模拟，结果见图3。

由图3a可知，黄粉虫纤溶酶的等电点为9．16，在人体内正常生理环境下，该酶带正电。而纤维蛋白通常带负电荷，所以黄粉虫纤溶酶很容易靠近纤维蛋白，并与之结合。因此，黄粉虫纤溶酶对血栓有一定的靶向作用。

对于水溶性球形蛋白，亲水值较低的氨基酸，趋向于蛋白质的内部，亲水值较高的氨基酸，趋向于蛋白质的外部。由图3b可知，H72、S212、D207亲水值较低，而且H72和D207是局部亲水值最低点，应该在球蛋白内部；S228、G230亲水值较高，应该在球蛋白外部，与三级结构相符。

图3 等电点模拟（a）、亲水性模拟（b）和柔性模拟（c）Fig．3 The isoelectric point analogue（a），hydrophilicity analogue（b）and flexibility analogue（c）

由图3c可知，活性部位H72、D117、S212的柔性值比较小，几乎是整条链上最小的区域，说明组成酶活性中心的3个氨基酸残基的空间位置相对固定，因而活性中心的相对结构很稳定，在自然状态下不会随意发生变形，底物结合部位中S228、G230的柔性值比较小，说明这两个残基的空间相对位置比较固定，D207的柔性值比较大，这符合酶促反应动力学诱导契合理论。在结合底物时，酶的结合部位和底物的结构都发生了一定的形变（柔性才能形变），两者在空间结构上刚好互补，从而能很好地契合。全链柔性分析表明，黄粉虫纤溶酶的活性中心和底物结合部位符合酶催化机理，从另一侧面证明了活性中心预测的准确性。

2．4 纤维蛋白水解部位结构分析

体内纤维蛋白的溶解是纤溶酶作用于精氨酸－赖氨酸肽键，使之断裂的过程［11，12］。

3 结论

利用生物信息学方法，模拟黄粉虫纤溶酶的三维结构，并对其全序列进行了分析。确定黄粉虫纤溶酶的活性中心为 H72、D117、S212，底物结合部位为D207、S228、G230。黄粉虫纤溶酶属于水溶性球蛋白，其纤溶活性中心位于球蛋白表面凹穴处。推测其催化纤维蛋白水解的机理是作用于精氨酸－赖氨酸肽链，使不溶性纤维蛋白水解成可溶性蛋白。

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