不同粒径聚苯乙烯微塑料对黄粉虫的生物毒性研究

李鹏浩,李 哲,王 琼,马 怡,牛清雨,郭笑盈*

(1.郑州大学生态与环境学院,河南 郑州 450001;2.郑州大学环境与资源国际联合实验室,河南 郑州 450001)

21世纪开始,塑料行业逐渐成为医疗保健、能源生产、航空航天、汽车、海事、建筑、电子、包装和纺织等其他经济领域许多产品和技术创新的关键推动者[1]。全球塑料的生产和使用总产量已经从1950年的1.7×106t增至2020年的3.67×108t[2-3]。目前,中国已经成为全球最大的塑料生产国和消费国,2020年中国的塑料制品全年产量已达到1.17×108t,占全球塑料产量的32%,其中泡沫塑料制品占比为3.37%,废弃塑料总量为3.84×107t,再生利用率仅为17.6%[4]。大量的塑料固体废弃物难以得到合理和有效处置,其中约79%的废弃塑料堆积在垃圾填埋场或放置于自然环境中,其中约12%的废弃塑料被高温焚化[5-6]。通过各种途径进入环境中的塑料垃圾,在风力、紫外线照射、水力冲刷等理化因素的作用下会逐渐老化,分解成更小的塑料碎片,导致了一类新型污染物——微塑料(microplastics,MPs)污染的出现[7]。

微塑料通常被定义为尺寸小于5 mm的不溶于水的有机聚合物固体颗粒[8]。微塑料颜色形状多种多样,且大部分密度与水接近,悬浮在水中容易被水生生物误食,从而进入食物链。目前已经在超过2 000种海洋生物中检测到了微塑料,包括一些人类食用的鱼类和甲壳类动物[9]。由于小型水生生物具有生长周期短、体型小和易于观察等优点,因此目前关于微塑料生物毒性研究的模式生物主要集中在小型水生动物,如牡蛎幼虫、水蚤等[10-11]。

Yang等[12-13]针对黄粉虫(Tenebriomolitor)对微塑料的生物降解机制进行了系统研究,结果发现黄粉虫肠道内的微生物菌群能在24 h内快速降解和矿化聚苯乙烯(PS),并且将摄入的PS转化为CO2和生物量;也有一些研究发现[14-16],黄粉虫能够摄食PS泡沫塑料,且其有明显的生长现象,但对塑料的取食具有选择偏爱性,较为偏爱取食泡沫化程度较高的塑料,并且对PS的降解能力和降解率最高;Tsochatzis等[17]研究表明,在向黄粉虫喂食麸皮与PS掺杂的饲料时向饲料中加入H2O,将有助于提高PS的降解率。针对黄粉虫对PS的潜在降解能力和黄粉虫摄食PS后肠道内优势菌群及排泄物中PS的降解产物已有研究报道,但关于不同粒径聚苯乙烯微塑料颗粒对黄粉虫生物毒性的研究较少[17-21]。为此,本研究采用黄粉虫为受试生物,通过向黄粉虫喂食不同比例的聚苯乙烯(PS)颗粒与麸皮组合以及不同粒径PS小球,测定试验周期内黄粉虫生物学指标及组织内抗氧化酶水平等参数,探究并分析不同粒径与不同摄食比例的微塑料对黄粉虫生命体征和组织水平生物毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 黄粉虫与聚苯乙烯

试验所用黄粉虫(Tenebriomolitor)和麸皮均采购于山东省菏泽市牡丹区花鸟市场,其中黄粉虫平均长度为1.5 cm;粒径为30 μm高密度聚苯乙烯(HDPS)采购于科信达高分子材料有限公司,粒径为1 mm和4 mm低密度聚苯乙烯(LDPS1、LDPS4)采购于上海文言塑化有限公司。

在试验开始前,先将黄粉虫分为10份,每份约350条,分别置于20 cm×12 cm×15 cm的孵育箱,在恒温培养箱(ZWY-240上海智城分析仪器制造有限公司)中以麸皮驯养3 d,培养箱温度设定为(25±0.2) ℃,一天中16 h照明、8 h避光,避免太阳直射。在试验开始后,每3 d对黄粉虫粪便称重,同时对每组存活的黄粉虫进行称重,随后将孵育箱清理干净并投加新的饲料。

聚苯乙烯(polystyrene,PS)通常被认为是具有耐久性和非生物降解性的一种常见的塑料产品,主要用于食品包装、建筑保温、电子电器设备、冰箱内胆、镜框等[2]。对本试验所用的3种聚苯乙烯样品(HDPS、LDPS1、LDPS4)进行了傅里叶红外光谱扫描(Frontier,美国PekinElmer有限公司),通过特征官能团以确认塑料类型;利用扫描电子显微镜(Nova Nona 450,美国FEI有限公司)观察高密度聚苯乙烯样品(HDPS,粒径为30 μm)的微观表面状态;利用表面积和孔径分析仪(ASAP2460,上海麦克莫瑞提克有限公司)测定高密度聚苯乙烯样品(HDPS,粒径为30 μm)的比表面积和孔容。

1.2 黄粉虫饲养条件及数据记录

本试验将挑选出大小较一致的黄粉虫(长度为13～16 mm)随机分为5组,每组设2个平行试验,每个平行试验初始黄粉虫数量约350条(图1),整个试验过程中黄粉虫的饲养条件见表1。

表1 黄粉虫饲养条件

图1 试验开始时的黄粉虫Fig.1 Tenebrio molitor at the beginning of the experiment

根据预试验饲养经验,本试验中黄粉虫的驯养期为3 d,培养箱温度设定为(25±0.2) ℃,一天中16 h照明、8 h避光,随后开始为期24 d的试验,其中麸皮对照组(FP)、10% HDPS混合组(HPS10)和25% HDPS混合组(HPS25)需每3 d投喂2 g相应配比的饲料,而1 mm LDPS单一组(LPS1)和4 mm LDPS单一组(LPS4)两组的塑料小球消耗较慢,因此只需在第一次投喂时足量投加微塑料。本试验以6 d为一个时间周期,统计各个时间周期内每组黄粉虫的摄食量、排泄量、蜕皮量、死亡量。

1.3 黄粉虫生物组织内抗氧化酶水平测试

黄粉虫生物组织内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)的含量均采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒进行测定。匀浆液提取过程中用到的所有耗材提前预冷,试验过程中使用的泡沫箱加冰预冷。从各个组中分别随机取20条黄粉虫,称重后置于50 mL塑料离心管中,用去离子水将黄粉虫润洗干净,然后用滤纸擦干黄粉虫体表残余的水,随后将黄粉虫直接制备成匀浆液进行分析。未能及时进行匀浆制备的黄粉虫储存于-80 ℃超低温冰箱内,以确保黄粉虫生物组织内抗氧化酶水平稳定。

试验采用低温研磨的方法制备匀浆液,先取清洗干净的黄粉虫(或-80 ℃保存下的黄粉虫)放置于提前预冷的80 mL灭菌烧杯中,按1∶9 (w/v)加入预冷生理盐水;然后用解剖剪将20条黄粉虫剪成约2 mm长的小段,随后立刻转移至10 mL匀浆管上下抽提研磨1 min至溶融状态,匀浆时将匀浆管置于冰水浴中,以减少匀浆过程中的物理摩擦放热对酶活性的抑制,并将研磨液全部转移至5 mL塑料离心管内;最后使用低温离心机在4 ℃条件下以转速4 000 r/min离心15 min,将上清液平分成3份,每份约1.5～2.0 mL倒入微型离心管中,随后直接进行分析测试。

2 结果与讨论

2.1 聚苯乙烯(PS)的形貌表征与理化属性

本试验所用到的3种聚苯乙烯微塑料(HDPS、LDPS1、LDPS4)样品的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图,如图2所示。

图2 3种聚苯乙烯微塑料(HDPS、LDPS1、LDPS4)样品的 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图Fig.2 FT-IR spectra of three polystyrene samples (HDPS, LDPS1,and LDPS4)

由图2可以看出:3种聚苯乙烯(HDPS、LDPS1、LDPS4)样品在3 102～3 002 cm-1处均有明显的吸收峰,对应聚苯乙烯分子中大量C—H键的伸缩振动;样品在2 925 cm-1处有明显的吸收峰,对应聚苯乙烯分子中CH2不对称伸缩振动;样品在1 601～1 451 cm-1处的吸收峰属聚苯乙烯苯环骨架振动模式;样品在1 027 cm-1和750 cm-1处的红外吸收峰,分别对应聚苯乙烯分子中苯环上C—H面内和面外弯曲振动模式。

FT-IR分析结果表明,本试验所用的所有聚苯乙烯微塑料样品均符合聚苯乙烯分子结构的红外特征吸收峰[22]。

粒径为30 μm的高密度聚苯乙烯(HDPS)样品的扫描电镜(SEM)图,如图3所示。

图3 粒径为30 μm的高密度聚苯乙烯(HDPS)样品的扫 描电镜图Fig.3 SEM of 30 μm high-density polystyrene (HDPS) microplastic samples

由图3可以看出:HPS10组和HPS25组使用的HDPS样品呈现出规则的球体形态,表面光滑无裂痕;HDPS样品的比表面积为3.733 m2/g,孔容为0.008 cm3/g,LDPS1和LDPS4样品未能测出有效比表面积。可见,相比于传统碳材料和生物炭,聚苯乙烯微塑料的比表面积和微孔孔容较小[23-24]。

2.2 黄粉虫生长情况

在整个黄粉虫饲养过程中,每周期(6 d)对每组存活黄粉虫进行称重,记录存活黄粉虫总质量,见图4。此外,还考察了黄粉虫在饲养过程中的死亡量、蜕皮量、排泄量、累计聚苯乙烯摄食量,见图5至图8。

图4 不同试验组存活黄粉虫总质量随时间的变化Fig.4 Total mass of surviving Tenebrio molitor in different experimental groups over time

图5 不同试验组黄粉虫死亡量随时间的变化Fig.5 Mortality of Tenebrio molitor deaths in different experimental groups over time

由图4和图5可以看出,

1) 试验开始时,每组存活黄粉虫总质量控制在(8.35±0.55) g,FP组存活黄粉虫总质量在前3个周期(第0～18天)稳定在7.99～8.20 g之间(第18天存活约320条),每周期黄粉虫死亡量稳定在(10.5±1.5)条;从FP组存活黄粉虫总质量的稳定和黄粉虫死亡量来看,在合适的饲养条件下,每周期黄粉虫会有(3.11±0.54)%的自然死亡,而在去除掉死亡的黄粉虫后,其总质量依旧稳定,表明单条存活黄粉虫质量在增加,黄粉虫整体生长态势良好。

2) HPS10组存活黄粉虫总质量在前3个周期表现出与FP组存活黄粉虫总质量相同的趋势,但从第4周期(第19～24天)开始HPS10组存活黄粉虫总质量有明显下降;在第4周期结束时(第24天)HPS10组存活黄粉虫总质量较开始时减少15.3%,而FP组存活黄粉虫总质量只减少了8.8%。相比于HPS10组,HPS25组黄粉虫饲料中增加了15%的HDPS含量,存活黄粉虫总质量表现出明显的下降趋势,从试验开始时的8.5 g,降低至第3周期末(第18天)的7.4 g,第4周期结束时(第24天)存活黄粉虫总质量只有6.37 g,相比于试验开始时减少了25.1%。由此可见,在有麸皮的饲养条件下,低浓度HDPS的添加(HPS10组)在短时间内对黄粉虫的生长并无明显的影响,而高浓度HDPS的添加(HPS25组)表现出了对黄粉虫生长的抑制作用。徐世才等[25]研究发现,不同麸皮与泡沫塑料的喂食比例会影响黄粉虫的生长情况,不同泡沫塑料与麸皮喂食的比例下黄粉虫的生长呈现抛物线的趋势,泡沫塑料与麸皮的喂食比例为1∶6时(泡沫塑料占比为14.28%)泡沫塑料的降解率最大,且与纯麸皮喂食黄粉虫的生长情况无差别;Lou等[20]的研究也表明,PS与麸皮喂食的比例为1∶7时将有助于黄粉虫的生存和生长。本试验中HPS10组黄粉虫同样表现出较好的生长趋势,通过对试验周期内每天黄粉虫的死亡数量进行单因素方差分析,结果显示FP组与HPS10组之间无明显差异(p>0.05),而FP组与HPS25组之间黄粉虫的生长情况有显著差异(0.01

3) LPS1和LPS4组相较于其他组,其存活黄粉虫总质量呈现明显的下降趋势,同时黄粉虫死亡量也更多。在不添加麸皮的条件下,只喂食LDPS,根据图8,黄粉虫在整个试验过程中摄食的累计LDPS量仅为0.051 g(LPS1组)和0.034 g(LSP4组)。黄粉虫在取食整块立方体形状且边缘易于附着的聚苯乙烯泡沫塑料时,其啃食降解率能达到99.3%[26]。此外,聚苯乙烯塑料的硬度及表面粗糙程度也与黄粉虫的取食速率有关[27]。黄粉虫能够降解聚苯乙烯,可能是其肠道内微生物的作用,而不是黄粉虫自身分泌的酶在作用[13,28]。本试验中黄粉虫对聚苯乙烯摄食量低的原因可能是由于聚苯乙烯颗粒小球粒径超过了黄粉虫的口径,而且试验所用的聚苯乙烯小球表面较为光滑,黄粉虫难以附着在聚苯乙烯小球上,且啃食较为困难。同时,在缺少食物的条件下,黄粉虫之间存在互相残杀的现象,因此导致存活黄粉虫总质量不断减少,其死亡量不断增加[14,29]。

由图6可以看出:在有麸皮的饲养条件下,FP、HPS10和HPS25三组黄粉虫的蜕皮量与饲养时间之间呈现出正相关性(p<0.05),这是由于黄粉虫在其幼虫生长阶段会蜕皮,以适应体型的增长,其蜕皮量也从侧面反映了黄粉虫生长的趋势;只添加LDPS的两组黄粉虫的蜕皮量整体呈现下降的趋势,这是由于黄粉虫在没有麸皮的饲养条件下只摄食LDPS,但摄入量较少(图8),整组黄粉虫摄入能量较少,黄粉虫自身的生长受到了限制,因此黄粉虫在蜕皮量上也表现出整体下降的趋势。

图6 不同试验组黄粉虫蜕皮量随时间的变化Fig.6 Molting amount of Tenebrio molitor in different experimental groups over time

图7 不同试验组黄粉虫排泄量随时间的变化Fig.7 Excretion amount of Tenebrio molitor in different experimental groups over time

图8 不同试验组黄粉虫累计聚苯乙烯摄食量随时间的 变化Fig.8 Cumulative microplastic intake of PS by Tenebrio molitor in different experimental groups over time

由图7可以看出:在黄粉虫排泄量上,并非是FP组的黄粉虫排泄量最高, 而是HPS25组黄粉虫的排泄量最高,这可能是因为黄粉虫摄食含有高浓度HDPS(HPS25组)的麸皮饲料后,黄粉虫对HDPS的消化不完全,其中47.7%转化为CO2,49.2%随粪便排出,因此导致其排泄量更高[12-13];LPS1和LPS4组黄粉虫的排泄量高于摄入的LDPS质量,这可能是因为在缺少食物的条件下,黄粉虫之间互相啃食,死亡黄粉虫被存活黄粉虫当作食物吞食[29]。虽然在试验过程中每天将死亡黄粉虫挑出,避免存活黄粉虫吞食死亡黄粉虫,但难免会有少量吞食情况发生。

2.3 黄粉虫生物组织内抗氧化酶水平

活性氧物质是指含氧原子的自由基,是由氧通过直接或者间接的方式转变而来,包括氧自由基及其衍生物两大类。正常状态下,机体产生的自由基和清除自由基的速率处于动态平衡状态,而当外源性因素物质的干扰打破这种平衡时,活性氧便会持续累积产生,增加到一定水平时就会对机体的蛋白质、脂质和DNA等大分子造成损伤[30]。活性氧物质的生成被认为是微塑料毒性的主要致毒机理。

在试验的第4周期末(第24天),对黄粉虫组织内抗氧化酶水平进行了测试,其测试结果见图9。

注:柱状图内每个柱形图上部的字母a、b、c是差异性分析的结果,相同字母表示它们之间的差异性不显著(p>0.05),不同字母表示它们之间的差异性显著(p<0.05)。图9 不同试验组黄粉虫生物组织内抗氧化酶水平对比Fig.9 Antioxidant enzyme levels in Tenebrio molitor tissue in different experimental groups

由图9可以看出:

1) 在有麸皮饲养条件下,黄粉虫生物组织内SOD、GPx水平相对较低,将有麸皮HDPS组(HPS10、HPS25)与纯LDPS组(LPS1、LPS4)饲养条件下黄粉虫组织内CAT 水平进行方差分析,发现两者之间并无显著差别(p>0.05);相较于FP组,LPS1和LPS4组黄粉虫生物组织内SOD水平分别升高了2.21倍和1.87倍,GPx水平分别升高了3.55倍和3.65倍,黄粉虫生物组织内SOD和GPx水平的显著升高可能是黄粉虫摄食LDPS导致的,也可能是由于没有麸皮,摄食的食物过少引起的,故未来在试验中应考虑完全不喂食的条件下黄粉虫生物组织内SOD、GPx的水平。

2) 通过对比纯麸皮(FP)饲养与麸皮掺杂HDPS(HPS10、HPS25)饲养条件发现,黄粉虫组织内SOD、GPx和CAT水平无明显差异(p>0.05),表明黄粉虫在有正常食物来源的情况下,摄食一定量的PS对其自身生物毒性的影响较少;但麸皮掺杂HDPS的饲养条件下,黄粉虫生物组织内丙二醛(MDA)水平有显著升高(p<0.05)(图10)。生物组织内MDA的浓度变化可以反映机体内脂质过氧化程度,进而反映细胞受损程度[33-34]。 Tsochatzis等[35]研究发现,黄粉虫摄食含PS的麸皮饲料后,黄粉虫生物组织内关于细胞凋亡的生物标志物神经酰胺和心磷脂浓度较高,表明黄粉虫可以代谢PS,但会导致其应激水平增加。本研究中HPS10和HPS25组黄粉虫生物组织内MDA水平的显著升高同样表明黄粉虫摄食PS后对机体细胞有一定的损伤。

图10 不同试验组黄粉虫生物组织内丙二醛(MDA)水平 对比Fig.10 Malondialdehyde levels within Tenebrio molitor tissue in different experimental groups

3 结 论

1) 粒径是影响黄粉虫摄食聚苯乙烯(PS)的重要因素之一,黄粉虫对1 mm和4 mm粒径的PS小球摄食量较小,而在麸皮与HDPS掺杂的饲养条件下,黄粉虫能摄食较多的PS,且死亡量低。

2) 喂食黄粉虫掺杂了10%和25%HDPS的麸皮饲料,其中含有25%的HDPS会对黄粉虫的生长产生抑制作用。摄食含有25%的HDPS黄粉虫的排泄量为最高,这可能是由于黄粉虫摄食到体内的HDPS并不能完全被分解而导致。

3) 在有麸皮饲养的条件下,黄粉虫摄食PS对其自身生物毒性的影响较小,但还是会对其存在一定的细胞损伤。