肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的可溶性表达及纯化条件的优化

赵 芳，刘 叶，吕 静，代广知，谭树华

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京210009）

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF－Related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）或称凋亡素2配体（Apoptosis ligand，APO－2L）是肿瘤坏死因子（TNF）超家族的新成员。人TRAIL分子由281个氨基酸组成，为Ⅱ型跨膜蛋白。TRAIL能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对多数正常细胞没有杀伤活性［1－4］，因此在肿瘤免疫治疗中有很广阔的应用前景。TRAIL胞外区部分形成的可溶性多肽（sTRAIL）已具有全长TRAIL的活性，也能与TRAIL的天然受体特异性地结合，使信号传导途径被激活，最终导致细胞凋亡［5，6］。

作者采用PCR方法，以人胎盘cDNA为模板，特异性地扩增出编码TRAIL的可溶性片段（114～281个氨基酸）即sTRAIL的基因，然后成功构建sTRAIL的原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，优化了sTRAIL的纯化条件，获得高纯度的sTRAIL，并测定了其生物学活性。

1 实验

1．1 质粒、菌种和培养基

克隆载体pMD19－T，Takara公司；表达载体pTASH、大肠杆菌JM109均为自行保存。

LB培养基：蛋白胨1%，酵母提取物0．5%，氯化钠1%，氨苄青霉素100mg·L－1，pH值7．0。

发酵培养基：蛋白胨1%，酵母提取物0．5%，谷氨酸钠4%，麦芽汁1%，磷酸二氢钾0．671%，磷酸氢二钠0．757%，氨苄青霉素100mg·L－1，pH值6．5。

1．2 工具酶及试剂

Taq酶、限制性内切酶Eco RⅠ和 Hind Ⅲ、T4DNA连接酶，Takara公司；人胎盘cDNA，康为世纪公司；dNTP，南京生兴公司；兔抗人TRAIL蛋白的抗体，巴傲得生物公司；HRP标记的羊抗兔IgG，BOSTER 公 司；SP－Sepharose FF、Q－Sepharose FF，GE公司。

实验用试剂均为国产分析纯。

1．3 方法

1．3．1 sTRAIL基因的克隆

1．3．1．1 引物设计与合成

参考已报道的sTRAIL的cDNA序列［6］，根据表达载体pTASH多克隆位点特点设计一对引物（由上海捷瑞公司合成），引物序列如下（下划线部分为引入的Eco RⅠ、HindⅢ酶切位点）：

P1：5′－CCGAATTCATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAG－3′

P2：5′－GTAATCAAGCTTAGCCAACTAAAA－AGGCCCCGAAAAAACTG－3′

1．3．1．2 PCR扩增sTRAIL基因

以人胎盘cDNA作为PCR反应的模板，以引物P1、P2PCR扩增sTRAIL基因。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，50℃ 30s，72 ℃90s，30个循环；72℃10min。取纯化的TRAIL PCR产物与pMD19－T载体连接，通过Amp抗性筛选重组质粒，经PCR鉴定为阳性，提取阳性菌落的质粒DNA，用酶切鉴定，阳性克隆质粒送上海美吉生物科技有限公司测序。

1．3．2 sTRAIL表达载体和工程菌的构建

用Eco RⅠ和HindⅢ 双酶切pMD19－TRAIL和原核表达载体pTASH，回收目的片段，用T4DNA连接酶连接。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，在含Amp的LB培养板上挑取单菌落，经PCR鉴定，选取PCR阳性克隆，于LB培养液中37℃下摇床培养过夜，提取质粒，用Eco RⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。挑取阳性克隆进行测序鉴定以验证表达载体序列。最终筛选出目的菌株。

1．3．3 sTRAIL的表达

取工程菌单菌落接种于含100mg·L－1Amp的LB培养液中，37℃下振荡培养过夜；次日按2%接种量接种于含 100mg·L－1Amp、100μmol·L－1ZnSO4的发酵培养液中，37℃下振荡培养24h；取出培养物，离心收集菌体，超声破碎后取细胞裂解产物，离心，收集上清和沉淀，用SDS－PAGE分析表达产物及表达形式。

1．3．4 sTRAIL的分离纯化

1．3．4．1 SP－Sepharose FF和 Q－Sepharose FF结合纯化

收集表达后菌体，按10mL·g－1（湿重）加入到缓冲溶液［20mmol·L－1Tris－HCl（pH 值8．5），1mmol·L－1EDTA，500mmol·L－1NaCl］中，超声破碎细菌，13 000r·min－1离心30min，取上清。以30BV透析外液（20mmol·L－1Tris－HCl，100μmol·L－1ZnSO4，pH值7．6）透析24h，中间换1次透析外液，过SP－Sepharose FF柱，NaCl连续梯度洗脱，收集0．3 mol·L－1NaCl洗脱峰。再以30BV的透析外液（20 mmol·L－1Tris－HCl，100μmol·L－1ZnSO4，pH 值9．0）透析24h，中间换1次透析外液，过 Q－Sepharose FF柱，NaCl连续梯度洗脱，收集0．2mol·L－1NaCl洗脱峰，用纯水透析，冻干。

1．3．4．2 SP－Sepharose FF和RP－HPLC结合纯化

首先按1．3．4．1的方法过 SP－Sepharose FF柱，收集0．3mol·L－1NaCl洗脱峰；再使用Bio－rad公司的DuoFlow制备型液相色谱系统［色谱条件：色谱柱为 Kromasil 5－C18色谱柱（10mm×250mm），流动相A相为0．1%TFA／H2O、B相为0．1%TFA／CNCH3，流速1mL·min－1，梯度为：20min，15%～40%B；40min，40%～65%B；5min，65%～100%B］，收集53%B相洗脱峰，冻干。

1．3．5 sTRAIL蛋白纯品的鉴定

采用SDS－PAGE法分析sTRAIL蛋白纯品的纯度、Western blot法分析其免疫原性、BCA法测定其蛋白含量，各实验均按常规进行。Western blot一抗为兔抗人TRAIL蛋白多克隆抗体（效价为1∶500），二抗为HRP标记的羊抗兔IgG（效价为1∶5000），检测用ECLTMKit（增强化学发光试剂盒）。

1．3．6 sTRAIL生物学活性测定

取对数生长期的HepG2细胞以每孔5×103个接种于96孔板，培养24h后加入sTRAIL纯化蛋白至浓度（nmol·L－1）分别为5．15、10．31、20．62、41．24、51．55、103．09，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养72h，显微镜下观察MTT法染色分析结果。细胞抑制率依下式计算［3］：

式中：As、Ac分别为样品和对照在570nm下的吸光度值。

2 结果与讨论

2．1 sTRAIL基因的克隆

以人胎盘cDNA为模板，以相应引物进行PCR扩增得到约500bp的特异片段（图1）。片段大小与预期目的基因大小相符。回收此扩增片段，克隆入pMD19－T载体中进行测序，测序结果与所报道的sTRAIL序列一致，在序列两端可见引入的Eco RⅠ和HindⅢ位点。将阳性克隆质粒DNA命名为pMD19－TRAIL。

图1 sTRAIL的PCR扩增Fig．1 PCR Amplification of sTRAIL

2．2 sTRAIL表达载体的构建、鉴定

用Eco RⅠ和HindⅢ双酶切pMD19－TRAIL和表达载体pTASH，然后亚克隆，构建重组质粒pTA－sTRAIL，进行PCR鉴定（图2a）。PCR阳性克隆用Eco RⅠ和HindⅢ双酶切，结果符合预期（图2b）。DNA测序结果与所报道的sTRAIL序列一致，证明sTRAIL表达载体构建成功。

图2 重组质粒pTA－sTRAIL的鉴定Fig．2 Identification of recombinant pTA－sTRAIL

2．3 sTRAIL的表达与纯化

对sTRAIL表达产物进行SDS－PAGE电泳分析，观察到分子量与理论值（约19．6kD）相符的明显表达带（图3）。薄层扫描显示sTRAIL高效可溶表达，其表达量占菌体总蛋白的20%。破碎上清经SP－Sepharose FF柱纯化，目的蛋白得到初步纯化，纯度达76%；再经过 Q－Sepharose FF柱纯化，纯度达93%；而再经过RP－HPLC纯化，纯度可达98%以上（图4），即每升细菌培养液可得到15mg纯化的sTRAIL。

图3 sTRAIL表达产物的SDS－PAGE分析Fig．3 SDS－PAGE Analysis of expression of sTRAIL

2．4 sTRAIL蛋白鉴定

将sTRAIL蛋白纯品进行SDS－PAGE分析后电转移至硝酸纤维素膜上，利用兔抗人TRAIL蛋白多克隆抗体作Western印记。结果显示sTRAIL蛋白纯品能与兔抗人TRAIL蛋白多克隆抗体发生特异性反应（图5）。

2．5 sTRAIL的生物学活性

为了检测纯化后sTRAIL蛋白的生物学活性，在HepG2细胞株中加入不同浓度的纯化sTRAIL，MTT结果显示，sTRAIL对HepG2细胞生长具有明显抑制作用并存在剂量依赖，IC50为48．82nmol·L－1（图6）。

2．6 讨论

目前，肿瘤治疗中一直应用具有细胞毒性的化学药物，这些药物在治疗肿瘤的同时也导致了机体的损伤和药物的抗性，因此希望利用基因疗法解决该问题。

6 MTT检测sTRAIL对HepG2细胞生长的抑制作用Fig．6 Determination of proliferation inhibition activity of sTRAIL to cell HepG2by MTT method

近年来研究表明，细胞凋亡与肿瘤发生、发展与消退有密切关系，肿瘤被认为是细胞增殖和死亡失衡所致。诱导肿瘤细胞凋亡可能是许多药物抑制肿瘤生长的机制之一，细胞凋亡成为抗肿瘤药物的新靶点［7］。其中TNF超家族可与其相应的受体结合而导致细胞凋亡，因而引起人们的广泛重视。TNF－α和FAS－L是TNF超家族中首先被克隆的两个分子，能有效地杀死肿瘤细胞，但也能导致正常组织的损伤，如TNF导致严重的炎症反应、FAS引起严重的肝损伤，因此难以进入临床应用。由于TRAIL能选择性地杀伤肿瘤细胞而对正常组织几乎无毒副作用，所以TRAIL及其受体一经发现便被认为具有巨大的临床应用价值，成为人们研究的热点［8］。

有报道发现膜结合型TRAIL在小鼠中亦可引发肝细胞毒性和肝损伤［9］。因此本研究选择TRAIL全长的第114～281个氨基酸部分，该部分是现在发现的无毒性、可溶性及生物学活性兼具的片段［10］。

pTASH是本实验室采用新型大肠杆菌L－门冬酰胺酶Ⅱ（ASPsⅡ）信号序列构建的分泌表达载体［11］，其多克隆位点上游Ptac是来自于Pkk223－3的Tac强启动子。构建成功的原核表达载体pTASH－sTRAIL在表达sTRAIL过程中无需IPTG诱导，就能高效表达目的蛋白。而且表达的sTRAIL蛋白大部分为可溶性，避免了包涵体蛋白变性、复性所引起的蛋白含量减少和生物学活性的降低。

在纯化sTRAIL时，考虑到其高等电点（pI＝8．9）［12］，先过 SP－Sepharose FF 柱，除掉大部分杂蛋白，再过Q－Sepharose FF柱进一步进行纯化，得到纯度达93%的sTRAIL。考虑到目的蛋白的稳定性，对纯化条件进行了优化。选择RP－HPLC代替Q－Sepharose FF柱，不仅使纯化步骤得以简化、蛋白更稳定，而且能得到纯度达98%以上的sTRAIL。

晶体结构的X－衍射分析表明［13］，天然的TRAIL由Zn2＋调节形成同源三聚体，Zn2＋隐蔽在活性中心，证明Zn2＋对维持TRAIL天然构象和其稳定性十分重要，因此在表达和纯化过程中都加入一定量ZnSO4以维持表达产物的天然结构和活性，取得了满意的效果。

3 结论

以人胎盘cDNA为模板，通过PCR技术特异性扩增出约500bp的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体sTRAIL基因。经双酶切后插入到原核表达载体pTASH的Eco RⅠ和HindⅢ之间，转化大肠杆菌JM109菌株。宿主菌主要以可溶形式表达sTRAIL，可溶形式sTRAIL蛋白达到60%。破碎上清经过SPSepharose FF和RP－HPLC两步纯化后，纯度达98%以上。重组蛋白在体外能明显诱导肿瘤细胞凋亡。

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