多指标优选抗疲劳体能茶的功效成分提取工艺

鄢 倩，张传鹏，李富玉，李海花，管华诗，刘红兵

（1．中国海洋大学海洋药物与食品研究所 海洋药物教育部重点实验室，山东 青岛266003；2．济南军区青岛第一疗养院中医科，山东 青岛266003）

抗疲劳体能茶是以普洱茶为主，加以红景天、淫羊藿等数味药食兼用中药提取物配制而成的茶剂，其主要功效成分是总黄酮，其中代表性的为红景天苷和淫羊藿苷，应作为产品质量控制的重要指标。

作者首先以红景天苷含量、淫羊藿苷含量和总黄酮含量为考核指标，选取乙醇体积分数、醇加量和提取时间为考察因素，通过正交实验优选出3种抗疲劳体能茶功效成分的提取工艺；进而利用小鼠游泳致疲劳模型，以小鼠负重游泳时间为评价指标，进行动物实验以确定最佳提取工艺。

1 实验

1．1 材料、试剂与仪器

普洱茶产自云南勐海。红景天、淫羊藿等药材（青岛市同仁堂药业有限公司），经中国海洋大学医药学院刘红兵副教授鉴定为《中国药典》收载品种。

红景天苷（批号11818－201005，含量99．9%）、淫羊藿苷 （批 号 110737－200415）、芦丁 对 照品 （批 号100080－200707，含量92．5%），国家药品与生物制品检定所；乙腈（色谱纯），山东禹王；液相用水为 Millipore双蒸水；其它试剂均为分析纯。

Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；AL204－IC 型 电 子 天 平，上 海 梅 特 勒 公 司；KQ3200B型超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；2800型紫外分光光度计，上海森信公司。

1．2 方法

1．2．1 正交实验

准确称取抗疲劳体能茶配方中药9份，每份10．0 g，采用乙醇回流法提取2次。合并提取液，滤过，减压浓缩至干，得中药提取物。分别测定红景天苷、淫羊藿苷、总黄酮的含量。并以其为考核指标，以乙醇体积分数（A）、醇加量（B）、提取时间（C）为考察因素，进行正交实验。正交实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素与水平Tab．1 Factors and levels of orthogonal experiment

1．2．2 动物实验

利用小鼠游泳致疲劳模型、以小鼠负重游泳时间为评价指标，对正交实验优化得到的3种不同提取工艺（功效成分工艺A1B2C3、总黄酮工艺A3B3C3、综合平衡工艺A1B3C3）进行考察，以确定最佳提取工艺。

1．2．3 实验动物分组及给药

SPF级昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，标准饲料适应性喂养2d后，随机分为空白对照组、功效成分组（工艺A1B2C3＋茶叶）、总黄酮组（工艺A3B3C3＋茶叶）、综合平衡组（工艺A1B3C3＋茶叶）。提取物给药剂量相当于原配方生药5g·kg－1，经口给药，灌胃容积0．02mL·g－1。空白对照组给予等体积的蒸馏水。

1．2．4 小鼠负重游泳时间的测试

根据《保健食品检验与评价技术规范（2003版）》测定小鼠的负重游泳时间。每天给药1次，连续给药29d。末次给药30min后，在小鼠尾根部负荷5%体重铅丝置于游泳箱中游泳。水深不低于30cm，水温（25±1．0）℃。参照MCARLE推荐的力竭判断标准（即小鼠头部沉入水中，经10s还不能返回水面视为力竭），记录自游泳开始至力竭的时间，作为游泳时间。数据以均数和标准差（±s）表示。各组数据均进行方差齐性检验，组间差异采用t检验。

1．3 分析检测

1．3．1 三氯化铝－紫外可见分光光度法测定总黄酮含量

1．3．1．1 芦丁对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品5．0mg，以60%乙醇溶解并定容至25mL，得到浓度为185mg·L－1的芦丁对照品储备溶液；移取储备液10mL至25mL容量瓶中，以60%乙醇定容，得到浓度为74mg·L－1的芦丁对照品溶液。

1．3．1．2 供试品溶液的制备

精密称取中药提取物，以60%乙醇溶解并定容至10mL；移取1mL提取液于10mL容量瓶中，以60%乙醇定容，即得供试品溶液。

1．3．1．3 最大吸收波长λmax的确定

分别移取1mL芦丁对照品溶液和1mL供试品溶液至10mL容量瓶中，各加入2mL 0．1mol·L－1的三氯化铝溶液，再以60%乙醇定容。室温放置显色20min后，以空白溶剂校正基线，在200～600nm波长范围扫描，确定最大吸收波长λmax。同时移取1mL供试品溶液于10mL容量瓶中，以60%乙醇定容，显色20min后，在200～600nm波长范围扫描。结果表明，三氯化铝显色后的对照品和供试品溶液在417nm处均有最大吸收，而未经三氯化铝显色的供试品在该处无吸收。

1．3．1．4 芦丁标准方程的建立

分别移取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL芦丁对照品溶液至10mL容量瓶中，各加入2mL 0．1 mol·L－1的三氯化铝溶液，以60%乙醇定容。室温放置显色20min后，于417nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标、芦丁浓度（c）为横坐标绘制标准曲线，拟合得回归方程A＝0．0376c－0．0163（R2＝0．9992），芦丁浓度在7．4～44．4mg·L－1范围内与吸光度呈良好线性关系。

1．3．2 HPLC法同时测定红景天苷和淫羊藿苷含量

1．3．2．1 对照品溶液的制备

称取红景天苷对照品12．6mg，以20%乙腈溶液溶解并定容至5mL，得2517．5mg·L－1的红景天苷对照品储备液；移取储备液1mL，以20%乙腈溶液稀释定容至2mL，得1259mg·L－1的红景天苷对照品溶液。

称取淫羊藿苷对照品9．5mg，以甲醇溶解并定容至5mL，得1900mg·L－1的淫羊藿苷对照品储备液；移取储备液1mL，以甲醇定容至2mL，得950mg·L－1的淫羊藿苷对照品溶液。

1．3．2．2 供试品溶液的制备

精密称取中药提取物，以20%乙腈溶液溶解并定容至2mL，于10 000r·min－1离心，取上清液，即得供试品溶液。

1．3．2．3 色谱条件

Waters Sunfire C18色谱柱（4．6mm×250mm，5μm），流动相为水（A相）－乙腈（B相），采用梯度洗脱：0～6min，14%B；6～16min，14%～33%B；16～30 min，33%B。流速1mL·min－1，进样量10μL，检测波长270nm，柱温35℃。在该色谱条件下，红景天苷和淫羊藿苷能得到很好的分离，且在红景天苷和淫羊藿苷的出峰位置，没有其它色谱峰的干扰（图1）。

1．3．2．4 标准方程的建立

吸取红景天苷对照品溶液1mL，逐级稀释至6个浓度，测HPLC图谱。以峰面积（A）为纵坐标、浓度（c）为横坐标绘制标准曲线，拟合得红景天苷线性回归方程A＝2．042c－26．15（R2＝0．9998），线性范围40～125 9mg·L－1。

同法，得淫羊藿苷线性回归方程A＝9．056c－81．36（R2＝0．9998），线性范围30～950mg·L－1。

2 结果与讨论

2．1 正交实验优选提取工艺

正交实验的结果与分析见表2。

图1 供试品的HPLC图谱Fig．1 The HPLC spectrum of Ti－neng Tea extract

表2正交实验结果与分析Tab．2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，无论是以红景天苷含量还是以淫羊藿苷含量为指标，各因素影响均不显著，最佳提取工艺均为A1B2C3；若以总黄酮含量为指标，因素B对总黄酮含量有显著影响，各因素影响主次为B＞A＞C，最佳提取工艺为A3B3C3；综合直观分析结果［1］，采用综合平衡法［2－5］，考虑提取效率及提取成本，确定综合平衡工艺为A1B3C3。

2．2 动物实验确定最佳提取工艺

动物实验测试不同组别的小鼠负重游泳时间，结果见表3。

由表3可知，各实验组都能极其显著延长小鼠负重游泳时间（P＜0．01），其中以综合平衡组（工艺A1B3C3＋茶叶）效果最好，其次是功效成分组。因此，确定抗疲劳体能茶功效成分的最佳提取工艺为A1B3C3，即用12倍量的50%乙醇回流提取2次，每次2．0h。

表3 不同组别小鼠负重游泳时间的比较（X±s）Tab．3 Comparison of swimming time of mice with weight loading of different groups

3 结论

通过考察红景天苷、淫羊藿苷、总黄酮的含量和药效，多指标优选抗疲劳体能茶的功效成分提取工艺。正交实验和动物实验确定最佳提取工艺为：以12倍量的50%乙醇回流提取2次，每次2．0h。在此工艺条件下，抗疲劳体能茶不仅功效成分的含量较高，而且具有很好的抗疲劳作用。含量与药效多指标评判方法综合考虑功效成分的提取效果和药效，客观、可靠，为中药复方提取工艺的优化研究提供了有益的参考。

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