非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立

曾少灵，廖立珊，唐金明，杨俊兴，阮周曦，张彩虹，曹琛福，吕建强，秦智锋，林庆燕，孙 洁，叶弈优，谢晓露，花群义＊

（1.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳518045；2.深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东深圳518045）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、高度接触传染性疾病。ASFV是一种虫媒性DNA病毒，仅有一个血清型，但有多个毒力差别的病毒株［1］。非洲猪瘟临床症状是高热、皮肤发绀、内脏器官严重出血、呼吸障碍、神经症状，病程短，病死率高，对养猪业危害很大，可造成毁灭性的严重后果，受到世界各国的高度重视［1］。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，在我国则列为一类动物疫病［2］。

1921年，ASF在肯尼亚被首次发现，此后在非洲、欧洲和美洲等地的数10个国家发生和流行，由于非洲国家部分地区的社会动乱和缺少疫病上报制度，目前ASF流行的实际状况比上报的信息可能要严重得多［1-3］。OIE疫情公告中，俄罗斯自2011年以来几乎每个月均有暴发ASF疫情，每次暴发均导致上万头猪死亡或被扑杀，对猪养殖业造成了重大损失［4-5］，同时对包括我国在内的与其接壤的周边国家和地区构成了严重威胁，对我国防控ASF的传入敲响了警钟［6］。

ASFV VP73基因全长1 188bp，编码的VP73蛋白是ASFV的主要抗原性结构蛋白，能够诱导机体产生中和抗体，且抗原性极为稳定，目前常被用作ELISA和Western blot检测ASFV血清抗体的主要抗原［1］。我国目前未发现ASF，作为防控监测使用的商业检测试剂盒基本上需从国外引进，检测技术依赖国外，检测成本昂贵，试剂购置周期长，一定程度上限制了我国监测ASF的力度和效果。本研究在昆虫细胞中实现了VP73蛋白的真核表达，获得了免疫原性良好的重组蛋白，为ASF的免疫血清学诊断试剂制备及监测技术储备奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠埃希菌（E.coli）DH5α、DH10Bac和载体pFastBac HTA、pFastBac HTCAT均为Invitrogen公司产品；载体pMD18-T为宝生物工程（大连）有限公司产品；质粒pBAD-VP73（含ASFV全长VP73基因，大小1 188bp）和昆虫细胞Sf9均为深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心动物检疫实验室保存。

1.1.2 试剂 非洲猪瘟病毒标准阳性血清、标准阴性血清由英国动物卫生研究所（IAH）Pribright实验室惠赠；猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒（2型）病和猪细小病毒病等猪阳性血清均为深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心动物检疫实验室保存；各种酶、核酸提取试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司；Cellfectin○RⅡ Reagent转染试剂盒、InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白胶染色试剂盒、抗猪IgG-HRP、Sf-900ⅡSFM培养基等购自Invitrogen公司；引物合成、DNA测序由Invitrogen公司完成。

1.1.3 仪器 ABI Veriti 96well Thermal Cycler型PCR仪，BioRad Universal HoodⅡ凝胶成像仪，Eppendorf 5415R型高速离心机，CTC-256型恒温恒湿培养箱，MA100型核酸／蛋白计数仪，I MARK型自动酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 重组转座载体pFastBac HTA-VP73的构建 根据GenBank中ASFV VP73基因序列，设计引物 primer F（EcoRⅠ）5′-G GAATTC ATGGCATCAGGAGGAG-3′和 primer R（PstⅠ）5′-A CTGCAG TTATGGTTTAAAGCGTAT-3′，扩增pBAD-VP73质粒中的全长VP73基因，将扩增片段克隆至pMD18-T，转化DH5α感受态菌，37℃培养16h，挑取阳性菌落，提取重组转座载体pMD18TVP73ZH送公司测序。通过EcoRⅠ和PstⅠ双酶切，将扩增片段从pMD18T-VP73ZH质粒中切出并定向插入转座载体pFastBac HTA，转化DH5α感受态菌，37℃培养24h，挑取阳性菌落，提取重组质粒pFastBac HTA-VP73，以酶切和PCR方法进行鉴定。

1.2.2 重组表达载体Bacmid-VP73的构建 将重组转座载体pFastBac HTA-VP73转化E.coli DH10Bac，涂于含 X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的筛选平板上，37℃培养48h，挑取白色菌落。同时将pFastBac HT-CAT和pFastBac HTA进行上述操作，分别作为阳性和阴性对照。提取重组Bacmid DNA （Bacmid-VP73、Bacmid-pFast-Bac HT-CAT 和 Bacmid-pFastBac HTA），使 用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作手册推 荐 的 引 物 （pUC／M13Forward：5′-CCCAG TCACG ACGTT GTAAA ACG-3′，pUC／M13Reverse：5′-AGCGG ATAAC AATTT CACAC AGG-3′）进行PCR鉴定。

1.2.3 重组Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞Bacmid-vp73、Bacmid-pFastBac HT-CAT 和 Bacmid-pFastBac HTA经脂质体化处理后，分别转染Sf9昆虫细胞，同时设置细胞空白对照，28℃培养3d，收集培养上清（含有重组杆状病毒）。上清物再感染正常Sf9细胞，通过显微镜观察细胞病变情况，一般36h～48h内出现病变现象，至大约72h有超过80%的细胞发生明显病变，此时收集细胞。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blot检测 分别收集细胞培养液和细胞进行SDS-PAGE电泳检测，确定表达产物在细胞中的存在形式。分别以六组氨酸抗体和非洲猪瘟标准血清抗体对表达产物进行Western blot检测，确定目标产物的表达情况和抗原性。

1.2.5 间接酶联免疫吸附试验（iELISA）的建立经SDS-PAGE检测确定表达产物主要存在于细胞内。以pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）悬浮清洗细胞，4 000r／min离心10min收集细胞。重复清洗1次～2次。以ELISA包被液重新悬浮细胞，反复冻融3次～5次后，以ELISA包被液稀释成不同浓度的裂解液，以核酸／蛋白计数仪测定裂解液中的蛋白浓度。分别取50μL裂解液包被ELISA板，4℃过夜。用洗液清洗1次，封闭液37℃封闭2h，清洗2次，备用。分别对ASFV标准阳性血清和标准阴性血清按1∶100、1∶200、1∶400和1∶800进行稀释，与猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒（2型）病和猪细小病毒病等猪阳性血清一起作为待测样品，采用包被好的ELISA板进行ASFV血清抗体的iELISA检测。加入各种血清样品后，37℃孵育45min，洗板4次，加入羊抗猪IgG为二抗，37℃孵育30min，显色，测定OD450nm值。

2 结果

2.1 ASFV VP73基因的扩增与重组质粒pMD18T-VP73ZH的鉴定

从pBAD-VP73重组质粒中扩增获得全长VP73基因，上下游分别含有EcoRⅠ和PstⅠ酶切位点，将片段克隆至pMD18-T质粒中。对重组质粒pMD18T-vp73ZH进行序列测定，结果表明含有ASFV VP73基因的完整读码框，基因上下游两端带有EcoRⅠ和PstⅠ酶切识别序列。重组质粒经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后进行凝胶电泳检测，可见大小约1 200bp的特异性条带，大小与预期相符（图1）。

2.2 重组转座载体pFastBac HTA-VP73的鉴定

采用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切定位插入的方式，将目标片段从pMD18T-VP73ZH重组质粒中切出并定向定点插入载体pFastBac HTA的强启动子下游，保证了插入基因的碱基精确对框，在表达时不发生错配，构建了重组转座载体pFastBac HTA-VP73。以引物对primerF和primerR对pFastBac HTA-VP73进行PCR鉴定。另根据酶切图谱分析结果，对pFastBac HTA-VP73分别进行EcoRⅠ和PstⅠ双酶切、SpeⅠ单酶切和HindⅢ单酶切鉴定。上述处理后的产物进行凝胶电泳检测，所得片段大小均与预期一致（图2），表明重组转座载体pFast-Bac HTA-VP73结构组成正确。

图1 重组质粒pMD18T-VP73ZH的酶切鉴定结果Fig.1 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pMD18T-VP73ZH

2.3 重组表达载体Bacmid-VP73的鉴定

分别用引物组primerF、primerR和pUC／M13 Forward、pUC／M13Reverse对Bacmid-VP73、Bacmid-CAT和Bacmid-HTA进行PCR鉴定，对产物进行凝胶电泳检测。前者PCR中，只在Bacmid-VP73为模板的PCR反应中出现了VP73基因1200bp的片段，而未插入VP73基因的Bacmid-CAT和Bacmid-HTA均没有，与预期一致（图3 A）。后者 PCR 中，Bacmid-VP73、Bacmid-CAT 为模板的PCR反应中分别出现了大约3 600bp和3 000bp的片段，与预期一致（图3B）。

图2 pFastBac HTA-VP73的PCR和酶切鉴定结果Fig.2 PCR and enzyme digestion identification of pFastBac HTA-VP73

图3 Bacmid-VP73的PCR鉴定结果Fig.3 PCR identification of Bacmid-VP73

2.4 重组杆状病毒Bacmid-VP73转染昆虫细胞Sf9的病变情况

将重组杆状病毒Bacmid-VP73转染昆虫细胞Sf9，同时设立Bacmid-pFastBac HT-CAT作阳性对照、Bacmid-pFastBac HTA作阴性对照，以及细胞空白对照，72h后观察细胞病变情况。与空白对照细胞组比较，发生病变的细胞组细胞数量明显较少，生长缓慢甚至停滞，细胞个体膨胀，体积变大，胞内出现颗粒物，部分细胞发生破裂、溶解。

2.5 SDS-PAGE和Western blot检测结果

分别收集细胞培养上清和细胞进行SDSPAGE电泳检测，结果显示表达的重组蛋白主要存在于细胞内，培养上清中可检测到少量重组蛋白。SDS-PAGE电泳后，蛋白胶先使用InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白胶染色试剂盒（按试剂盒操作说明书）对蛋白胶进行染色。该试剂盒的染液中含有六组氨酸抗体，可以与带有六组氨酸标签的重组蛋白结合，并在紫外光照射下发出亮光，该试剂盒的检测灵敏度与使用六组氨酸抗体进行的Western blot转膜杂交相当，由于操作简便和稳定性好，该检测方法目前已被广泛采用。在紫外光照射下，可见65ku和26ku 2个明显亮带（图4B），大小分别与VP73重组蛋白和阳性对照CAT蛋白的预期大小相符。

再以考马斯亮蓝对蛋白胶进行染色，有同样大小的2条表达条带（图4A）。

结果表明VP73重组蛋白和CAT阳性对照蛋白均在昆虫细胞Sf9中成功表达，且均带有6组氨酸标签。

采用非洲猪瘟标准血清对重组VP73蛋白进行Western blot检测，只在65ku处出现特异性印迹条带（表达产物有部分降解，因此印迹条带有拖尾现象），CAT阳性对照蛋白处没有印迹条带（图5）。表明昆虫细胞Sf9中表达的VP73蛋白能被相应的标准血清所识别，具有良好的反应原性。

2.6 非洲猪瘟间接酶联免疫吸附试验（iELISA）的初步建立

按方法1.2.5制备了蛋白浓度分别为64、32、16、8、4μg／mL的抗原包被液，完成ELISA板的包被。对各种稀释度的ASFV阳性标准血清和阴性标准血清，以及猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒（2型）病和猪细小病毒病等猪阳性血清进行ASFV血清抗体的iELISA检测，读取OD450nm值。

图4 Sf9细胞中VP73重组蛋白的SDS-PAGE检测结果Fig.4 SDS-PAGE of recombinant protein VP73 expressed in Sf9cells

图5 Sf9细胞中VP73重组蛋白的Western blot检测结果Fig.5 Western blot results of recombinant protein VP73 expressed in Sf9cells

以P／N≥2.1，且OD450nm≥0.4时的最大稀释度为最佳抗原包被液浓度和标准阳性血清最佳稀释度。经检测，确定最佳抗原包被液浓度为32μg／mL，ASFV标准阳性血清最佳稀释度为1∶200。阴性结果的平均OD450nm值为0.421，ASFV标准阳性血清结果的平均OD450nm值为1.742，相差1.32以上。在对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒（2型）病和猪细小病毒病等猪阳性血清的检测中未发现有交叉反应，初步建立了基于ASFV真核表达重组蛋白VP73的iELISA检测方法。

3 讨论

ASFV含有约150种蛋白，目前国内外研究较多的 ASFV 蛋白主要有 VP73、VP72、P54、I14L、j5R等［1，7］。VP73蛋白是 ASFV 的主要抗原性结构蛋白，能够诱导机体产生中和抗体，在感染初期就能检测到，且产量和抗原性都极为稳定，可作为ASFV血清学诊断的主要材料［1］。国外多个检测ASFV的ELISA商业试剂盒均基于VP73蛋白研制，表明VP73蛋白具备良好的特异性、抗原性和稳定性，这也是本研究选定非洲猪瘟VP73蛋白作为研究对象并研制基于VP73蛋白的iELISA试剂盒的主要原因。

当前，我国对于ASFV VP73蛋白的重组表达多见于原核表达［8-9］，而进行真核表达的鲜有报道，可能是因为真核表达比原核表达获得的重组蛋白的表达量一般较低的缘故，对下游蛋白利用可能带来一些影响［10］。本研究利用pFastBac HTA昆虫杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf9中成功表达了非洲猪瘟VP73蛋白，经SDS-PAGE检测和软件分析统计，VP73重组蛋白主要以可溶形式（超过80%）存在于细胞内，在细胞裂解离心沉淀的细胞碎片中也能检测到少量的VP73重组蛋白（少于15%）。VP73重组蛋白可溶部分约占Sf9昆虫细胞蛋白总量的35%～40%，实现了较高量的重组蛋白表达，有利于蛋白的纯化（另文发表）。

本研究选择对ASFV的VP73蛋白进行真核表达，还基于真核表达系统在蛋白翻译后修饰方面较原核表达系统存在的优势，即具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工，如二硫键的形成、糖基化、磷酸化和正确折叠等［10］，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，生物活性高，使用时对脊椎动物安全，适用于蛋白下游工程的推广应用。经InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白胶染色和Western blot检测，显示表达的VP73重组蛋白与六组氨酸抗体、ASFV标准阳性血清均能特异性结合，表明获得的重组蛋白VP73带有六组氨酸标签，也具备了良好的特异性和反应原性。以重组蛋白VP73为包被抗原建立的基于VP73重组蛋白的ASFV血清抗体iELISA方法，特异性和稳定性良好。下一步计划利用VP73真核表达重组蛋白制备特异性多抗或单抗，研制检测ASFV的竞争ELISA检测方法和试剂，有望打破我国长期以来依赖进口ASFV商业ELISA检测试剂盒的局面，开发具有我国自主知识产权的ASFV检测技术和试剂，进一步做好我国防控ASFV传入的技术储备。

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