赤腹松鼠肠道细菌分离鉴定及耐药性分析

权自芳，刘 丹，杨绍林，张 蕾，颜其贵，2＊

（1.四川农业大学动物生物技术中心，四川雅安625014；2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安625014）

赤腹松鼠（Callosciurus erythraeus）属于啮齿目，松鼠科，栖息于热带、亚热带森林中，以针叶林、混交林较为常见，亦可在山崖甚至居民点附近活动，以植物的嫩叶、果实、种子为主食，亦食用各种农作物［1］。赤腹松鼠对林木危害严重，是四川省主要的人工林害鼠之一［2-3］。随着森林旅游业的发展，人类和家畜与森林野生动物接触的机会和强度逐渐增大，赤腹松鼠数量巨大且分布广泛，如果携带病原细菌，将会成为家养动物及人类某些疾病的传染来源。细菌耐药已成为一个全球性问题，几乎所有细菌都能获得耐药基因，几乎每一种抗菌药物都能被细菌中某些物质抵抗或破坏［4］，给临床细菌性疾病的治疗带来了严峻的挑战，对人类健康构成了严重的威胁，野生动物源的细菌的耐药性的研究对细菌耐药性机理的研究具有重要的意义。

本试验以四川省某旅游景区的赤腹松鼠为对象，对赤腹松鼠所携带肠道细菌进行分离鉴定，探究是否有可致人兽患病的病原细菌及其能否危害旅游资源的开发利用；在分离鉴定赤腹松鼠肠道菌群的基础上进行药敏试验，评定在未给药状态下这些细菌是否对某些抗生素产生耐药性，为今后研究耐药传递机制提供素材。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 四川省某旅游景区健康赤腹松鼠33只。

1.1.2 培养基及主要试剂 Tryptone（OXOID Ltd.），Yeast Extract（OXOID Ltd.）购于Sigma公司；血琼脂、SP琼脂、DHL琼脂、普通营养琼脂、MH培养基购于北京奥博星生物技术有限公司；药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司；质粒小量抽提、凝胶回收试剂盒、Mix等购于天根生化技术有限公司；上游引物 、下游引物购于上海英俊生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料采集 采集赤腹松鼠小肠内容物33份，具体采集、保存方法按参照文献［5］进行。

1.2.2 细菌分离纯化 挑取小肠内容物分别于血琼脂、SP琼脂、DHL琼脂、普通营养琼脂划线接种，37℃培养48h，再根据菌落形态、大小进行纯化培养。根据平板上的菌落生长的形态、大小、颜色等进行分类，对每一类典型菌落进行革兰染色镜检，初步区分革兰阴性和阳性菌。再根据革兰染色特性和菌体形态，初步判定细菌类属，进行针对性纯化培养。

1.2.3 16SrRNA鉴定 细菌分离纯化后，抽提基因组DNA，利用16SrRNA细菌通用引物（上游引物：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′，下 游 引物：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′），进 行16SrRNA基因片段扩增。PCR扩增的反应体系为：5μL10×EX Taqbuffer（Mg2＋Plus），4μL dNTP Mixture（各2.5mmol／L），1μL 下游引物（20μmol／L），1μL上游引物（20μmol／L），0.25μL TaKaRa EX Taq （5U／μL），5.0μL模板 DNA，33.75μL ddH2O。PCR反应循环参数为：95℃10min；95℃30s，53℃30s，72℃90s，30个循环；72 ℃延伸7min［6］。

反应完成后，取5μL扩增产物，10g／L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。阳性PCR扩增产物回收纯化送上海英俊生物技术有限公司测序。

1.2.4 药敏试验 对鉴定的细菌进行药敏试验，采用美国临床实验室标准委员会CLSI推荐的K-B法进行操作。将分离鉴定的各种细菌挑取单个典型菌落接种于10mL LB培养基，37℃培养16h～24h，用无菌生理盐水将旺盛生长的LB培养基的浊度调整到光学上相当于0.5麦氏标准（1×108cfu／mL），用无菌棉拭子蘸取含菌培养液，均匀涂布在MH平板培养基上，加盖后室温下放置10min，用无菌眼科镊子将药敏纸片轻轻贴于平板上，37℃培养16h～18h，测量抑菌圈直径，结果判定依据杭州微生物试剂有限公司药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准进行。试验所选择药物包括氨苄西林、阿莫西林（复方）、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、头孢噻肟、阿米卡星、罗红霉素、氟苯尼考、大观霉素、林可霉素和泰妙菌素17种抗菌药物。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定

本试验从33只赤腹松鼠小肠内容物中共分离鉴定出117株细菌，对分离菌株进行16SrRNA基因PCR扩增，对扩增产物进行10g／L琼脂糖凝胶电泳观察，在1 500bp处均出现一条明亮的目的条带（图1）。将PCR产物回收纯化，送往上海英俊生物技术有限公司测序。将测序结果与GenBank中参考菌株16SrRNA基因核苷酸序列进行同源性分析比较，根据不同属细菌16SrRNA基因同源性为70%～90% ，而同一种内不同株间基因同源性大于99%的判定标准，表皮葡萄球菌、金色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、荧光假单胞菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和Weihenstephanensis芽胞杆菌等分离菌株与GenBank中相关参考菌株16SrRNA基因的核苷酸序列同源性均在99%～100% 之间，从而鉴定出这些细菌的种属。

图1 16SrRNA PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of 16SrRNA

赤腹松鼠肠道所携带的细菌主要有肠杆菌属、葡萄球菌属、芽胞杆菌属、肠球菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、明串珠菌属，其中大肠埃希菌32株、金黄色葡萄球菌28株、松鼠葡萄球菌16株、蜡样芽胞杆菌14株、粪肠球菌11株、表皮葡萄球菌3株、Weihenstephanensis芽胞杆菌3株、肺炎克雷伯菌2株、枯草芽胞杆菌2株、苏云金芽胞杆菌2株、Samanii芽胞杆菌2株、荧光假单胞菌1株、肠膜样明串珠1株（表1）。

2.2 药敏试验结果

对从赤腹松鼠肠道分离鉴定出的细菌进行K-B法药敏试验，结果表明，这些菌株对氟苯尼考、环丙沙星等药物敏感，而对大观霉素、氨苄西林等药物不敏感（表2）。

表1 赤腹松鼠肠道中细菌鉴定结果及检出数与检出率Table 1 Identification results，and detection number and detection rate of isolated bacterial strains of intestine of Callosciurus erythraeu%

3 讨论

细菌分离鉴定出117株，13种细菌，其中一些是可导致人畜患病的病原菌，如肺炎克雷伯菌、Weihenstephanensis芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、Samanii芽胞杆菌对人和动物都有一定的危害，其中蜡样芽胞杆菌在细菌性食物中毒中比较常见，占全部食物中毒事件的4.0%，在细菌性食物中毒据第4位［7］。而肺炎克雷伯菌是人类呼吸道和肠道的常居菌，可引起下呼吸道、泌尿道、消化道、手术切口、血液、颅内和皮肤软组织等多个部位感染，是医院感染和免疫缺陷者感染的重要病原菌。

表2 赤腹松鼠肠道分离菌株药敏试验结果Table 2 Drug susceptibility test of the isolated bacterial strains of intestine of Callosciurus erythraeus

另一些为潜在的条件致病菌，在动物机体抵抗力下降、饲养环境改变或运输等应激反应情况下可使动物发病甚至死亡，如表皮葡萄球菌在通常情况下不会致病，一般只在药物滥用者，接受免疫抑制治疗的病人，艾滋病病人和早产儿等免疫低下的个体中引起感染，是一种机会致病菌［8］，同时它也是人体皮肤以及黏膜表面常见的寄生菌，在这些部位分离到的葡萄球菌约占65%～90%。表皮葡萄球菌是医院感染中最常见的病原菌，也是引起医院内生物材料相关性感染的重要致病菌，主要在免疫力受损人群中容易引起感染，特别是在使用高分子材料留置物的病人中通过在体内留置物这类医学材料表面形成生物膜致病，表皮葡萄球菌致病机理与其能黏附在高分子材料表面并形成生物膜有关。大肠埃希菌通常情况下为肠道正常菌群，在饲养管理不良、卫生条件差、环境温差变化等综合应激因素下引起仔猪抵抗力降低，可诱发仔猪黄痢和白痢等。

其中也存在对生态有益的细菌，例如，荧光假单胞菌，它对于植物病害，特别是土传病害如根腐病、猝倒病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一种重要的有益微生物，在农业生产中具有十分重要的意义；而苏云金芽胞杆菌是目前世界范围内应用最广泛的一种生防微生物，对人畜及非靶标昆虫无害，具有巨大的经济价值和生态价值［9］。而其他大部分菌株都是动物体内正常的有益菌群，如枯草芽胞杆菌、粪肠球菌、肠膜样明串珠菌等。

药敏试验结果中金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌对大观霉素耐药；蜡样芽胞杆菌对氨苄西林、阿莫西林、罗红霉素、大观霉素耐药；克雷伯菌对氨苄西林耐药；苏云金芽胞杆菌、Weihenstephanensis芽胞杆菌、Samanii芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌对氨苄西林、阿莫西林、大观霉素耐药，这些与其他家养动物细菌耐药情况有所不同［10-12］。

临床中抗生素的使用，使细菌耐药出现及蔓延，而赤腹松鼠在未给药状态下肠道部分细菌所产生耐药性，应非抗生素诱导的结果。对于旅游景区而言，每个游客都是一个潜在的污染源，尤其一些缺乏生态环保意识的旅游者的不文明行为，给景区环境造成严重污染与破坏［13］。所产生旅游垃圾的成分比较复杂，大致可以分为两类，即有机垃圾和无机垃圾，无机垃圾包括各类塑料制品和包装物，还有口香糖、碎砖、石块煤灰、烟头、灰土、炉渣、废纸等；有机垃圾包括畜禽粪便、动物尸体、剩茶剩饭、瓜果皮核、菜根菜叶、鱼肉骨头、蛋壳和树叶杂草等，以及由于没有完善的旅游设施而在野外四处散布游客的粪便。当活动于旅游景区的赤腹松鼠与这些旅游垃圾接触，可能将畜禽及人类具有耐药基因细菌摄入体内，细菌间耐药基因（质粒和转座子等）进行转移，使其它细菌获得耐药基因，这为赤腹松鼠在未给药状态下肠道部分细菌产生耐药性的可能原因。

本研究以四川省某旅游景区的赤腹松鼠为对象，对赤腹松鼠所携带肠道细菌进行分离鉴定，结果表明，赤腹松鼠肠道细菌种群具有多样性，且存在致病菌，这为研究野生动物是否携带致病菌提供了参考。在分离鉴定松鼠肠道菌群的基础上进行药敏试验，结果表明，赤腹松鼠肠道部分细菌具有耐药性，这为进一步研究细菌携带的天然耐药基因以及耐药传递机制提供了素材。同时也为旅游环境的保护，提出了警示和建议，为更好、更安全的发展以野生动物为对象的休闲旅游娱乐活动和森林旅游活动提供一定的参考。

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