多杀性巴氏杆菌PurF蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

张爱芹，郭东春，刘家森，原冬伟，姜 骞，林 欢，崔玉东，曲连东＊

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 实验动物研究室，黑龙江哈尔滨150001）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）作为巴氏杆菌属最主要的代表菌，能够引起多种动物感染，导致急性、败血性传染病，包括禽霍乱、牛出血性败血症、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎和兔出血性败血症。多杀性巴氏杆菌属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属革兰阴性菌，主要以荚膜抗原和菌体抗原区分血清型。本菌呈世界性分布，给动物养殖业造成巨大的经济损失，被列为重点防控的疫病之一［1］。

purF基因编码磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶，该酶催化磷酸核糖焦磷酸转化为磷酸核糖胺，是嘌呤核苷酸从头合成的关键步骤。在大肠埃希菌中purF基因和cvpA基因与ubiX基因构成一个操纵子，purF基因缺失突变株中嘌呤的合成量降低，而多磷酸激酶基因的表达量增加［2］。肠炎沙门菌的p-urF基因缺失突变株是嘌呤营养缺陷体，嘌呤或芳香族氨基酸等合成途径的缺失突变体可作为疫苗用于细菌病原体的防控［3-4］。

应用DNA芯片技术对多杀性巴氏杆菌感染鸡的血液中差异表达基因的筛选中，purF、purD、purH和purN都表达上调［5］。应用转录序列选择性捕获技术对多杀性巴氏杆菌感染兔肝脏组织，筛选到purF基因的表达水平是上调的［6］。应用信号标签突变技术对多杀性巴氏杆菌毒力因子的鉴定中发现，purF基因缺失突变株对小鼠的致病性是减弱的［7］。伤寒沙门菌purF基因缺失突变株是减毒株，而都柏林沙门菌的purF基因缺失突变株毒力几乎不降低［8］。耻垢分支杆菌purF基因编码的蛋白与结核分支杆菌和麻风分支杆菌的PurF蛋白具有高度的同源性，能显著地弥补缺氧表型菌株，而该菌的突变株在缺氧条件下生存能力降低［9］。PurF蛋白在不同种属细菌致病中的作用不一致，而多杀性巴氏杆菌purF基因缺失突变株可能为减毒株，有作为基因工程疫苗预防巴氏杆菌病的潜力。

本研究应用原核系统表达兔多杀性巴氏杆菌C51-17株的PurF蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体，为进一步研究PurF蛋白在多杀性巴氏杆菌致病中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 多杀性巴氏杆菌C51-17株（A型）购自中国兽医药品监察所；大肠埃希菌DH5α、BL21（DE3）感受态、pPROEX-HTa表达载体为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物研究室保存。

1.1.2 实验动物 6只清洁级Balb／c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.1.3 主要试剂 EX-Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶和限制性内切酶EcoRⅠ和SpeⅠ等，宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA凝胶回收试剂盒，Promega公司产品；质粒小量提取试剂盒，增强型HRP-DAB底物显色试剂，Tiangen公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（H＋L）和辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG（H＋L），北京中杉金桥生物技术有限公司产品；其他常规试剂均为国产分析纯级产品；氨苄青霉素（Amp）浓度为100mg／L。

1.1.4 引物的设计与合成 参考GenBank（AE004439）登录的序列，设计一对引物，上游引物pPurFE1：5′-CCCGAATTCATGTGTGGTATT-GTTGG-3′（下划线为EcoRⅠ内切酶位点），下游引物pPurFE2：5′-GGGACTAGTTTATTTTTCATTGTGCAT-3′（下划线为SpeⅠ内切酶位点），引物由博仕生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备 BHI琼脂培养基挑取单 个 菌 落 于 裂 解 缓 冲 （10mmol／L Tris-HCl，0.5mol／L NaCl，1mmol／L EDTA，20g／L SDS）和终浓度为100μg／mL的蛋白酶K，置55℃水浴消化2h，冷至室温后分别用酚／氯仿／异戊醇及氯仿抽提后，无水乙醇沉淀，最后用50μL双蒸水溶解DNA，置-20℃保存备用。

1.2.2 purF基因的扩增 以P.multocida C51-17基因组为模板，用引物pPurFE1／pPurFE2扩增purF基因，PCR反应体系（50μL）：10×EX Taq buffer 5.0μL，2.5μmol／L dNTPs 4.0μL，10μmol／L上、下游引物各1.0μL，EX-Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌水36.5μL，模板2μL。PCR反应条件：94 ℃ 5min；94℃ 30s，50 ℃ 30s，72 ℃2min，30个循环；72℃延伸10min。10g／L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.3 原核表达载体的构建 回收PCR产物，分别用EcoRⅠ／SpeⅠ双酶切质粒pPROEX-HTa和purF回收片段，双酶切产物经胶回收试剂盒纯化后用T4DNA Ligase连接，转化入大肠埃希菌DH5α感受态细胞。提取重组质粒，酶切鉴定正确后的重组质粒命名为pHT-purF，送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4 重组蛋白的表达及Western blot检测 将鉴定正确的重组质粒pHT-purF转化大肠埃希菌BL21（DE3），挑单菌落培养过夜后按1∶100的比例接种于LB抗性（Amp＋）培养基中，37℃培养至菌液的OD 600nm达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol／L，37℃诱导表达5h，表达产物进行SDS-PAGE分析。将诱导的和非诱导的重组菌经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜上，50g／L脱脂牛奶封闭2h，以制备的灭活的C51-17菌体免疫的兔血清为一抗（1∶100稀释），37℃孵育1h，以HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀释）为二抗，37℃孵育1h，DAB显色，同时以未诱导菌株作为对照。

1.2.5 多克隆抗体的制备 将大量诱导表达的重组菌经超声波破碎，收集沉淀进行SDS-PAGE电泳，切下目的蛋白所在胶条，研磨，用适量PBS重悬，免疫注射8周龄左右的Balb／c小鼠，间隔2周免疫注射1次，共3次，三免后2周经眼眶静脉丛收集血液，分离血清。

1.2.6 ELISA检测多克隆抗体效价 以重组蛋白包被酶标板，10μg／mL，4℃包被过夜；PBST洗涤3次后加入含1∶3 000稀释的BL21（DE3）兔源阳性血清的5%脱脂乳作为封闭液，100μL／孔，37℃封闭2h；PBST洗涤3次后加入从1∶1 000开始倍比稀释的PurF多克隆抗体，对照组为相同稀释倍数的小鼠阴性血清，100μL／孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次后加入1∶20 000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，100μL／孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次后每孔加入100μL新鲜配置的TMB显色液，37℃暗反应10min后每孔加入50μL 2mol／L H2SO4终止反应；最后于450nm波长下测定吸光度值［10］。

1.2.7 Western blot检测 用多杀性巴氏杆菌C51-17菌体和purF基因缺失突变株进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜上，以制备的多克隆抗体为一抗（1∶100稀释），二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体。

2 结果

2.1 purF基因片段的PCR扩增结果

以多杀性巴氏杆菌C51-17的DNA为模板，特异性扩增purF片段，产物经10g／L的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段约为为1 500bp，与预期大小相符（图1）。

2.2 重组表达载体的鉴定结果

将回收的PCR产物和pPROEX-HTa载体进行EcoRⅠ／SpeⅠ双酶切，回收酶切产物，连接转化，随机挑取单菌落提取质粒，双酶切鉴定，证明重组表达质粒构建成功，命名为pHT-purF（图2）。将阳性重组子进行测序分析，再次证实插入片段序列正确，全长为1 515bp。

图1 purF基因扩增结果Fig.1 PCR products of purF gene

图2 重组质粒pHT-purF酶切鉴定结果Fig.2 Identification of recombinant pHT-purF by restricted endonuclease enzyme digestion

2.3 重组蛋白的表达和Western blot检测

将重组表达质粒pHT-purF转化E.coliBL21（DE3），用0.1mmol／L IPTG诱导细菌，菌体裂解产物的SDS-PAGE检测结果表明，重组蛋白PurF在分子质量约56.5ku处有特异性蛋白条带，与预期分子质量大小一致，融合蛋白主要以包涵体形式存在；Western blot检测表明，重组蛋白可以与多杀性巴氏杆菌制备的阳性血清发生反应（图3）。

图3 SDS-PAGE和Western blot检测鉴定PurF蛋白Fig.3 PurF protein detected by SDS-PAGE and Western blot

2.4 ELISA检测多克隆抗体效价

用重组蛋白PurF免疫Balb／c小鼠后，分离血清获得PurF蛋白的多克隆抗体，通过ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000（图4）。

2.5 多克隆抗体的制备和检测

Western blot检测表明该多克隆抗体能与多杀性巴氏杆菌C51-17菌体的PurF蛋白发生特异性结合，而与purF基因缺失突变株没有印迹条带，表明purF基因缺失突变株构建成功（图5）。

图4 ELISA法测定PurF多克隆抗体效价Fig.4 Determination of antibody titer

图5 Western blot检测purF基因缺失突变株Fig.5 Western blot analysis of purF mutant

3 讨论

本实验室鉴定出purF基因在多杀性巴氏杆菌感染的兔肝脏组织中表达是上调的［6］，信号标签突变技术也证实purF基因缺失突变株对小鼠的致病性是减弱的［7］。因此本实验室构建多杀性巴氏杆菌purF基因缺失突变株，验证PurF蛋白在构建的purF基因缺失突变株中的表达水平。

本研究采用原核表达系统表达融合蛋白His-PurF蛋白，在分子质量约56.5ku处有特异性印迹条带，融合蛋白主要以包涵体形式存在；Western blot检测表明，重组蛋白可以与多杀性巴氏杆菌制备的阳性血清发生反应，具有良好的抗原性。在试验设计之初拟采用His亲和层析纯化融合蛋白，但在纯化蛋白过程中，实际操作未能达到预期的目的，因此，在多抗的制备中，采用了切胶获得PurF蛋白，免疫Balb／c小鼠制备多克隆抗体。而报道中切胶免疫的方法可以满足抗体制备的要求，并且具有简单易行，快速，保持蛋白的完整性，包涵体蛋白无需复性，无需乳化蛋白等优点［11-14］。ELISA检测表明，制备的PurF蛋白多克隆抗体的效价可达到1∶128 000；Western blot检测表明，PurF蛋白位置上purF突变体中没有蛋白信号，在野生型菌株中有信号，表明该鼠抗血清能特异识别巴氏杆菌中的PurF蛋白。

本研究利用原核系统表达了多杀性巴氏杆菌C51-17株的purF基因，并制备了鼠抗PurF多克隆抗体，该抗体具有较高的效价。利用制备的鼠抗PurF多克隆抗体对多杀性巴氏杆菌野生型菌株和purF基因缺失突变株进行Western blot检测，purF基因缺失突变株中不表达PurF蛋白，验证成功的构建了purF基因缺失突变株。构建的多杀性巴氏杆菌purF基因缺失突变株为下一步验证PurF蛋白在细菌致病中的作用奠定了基础。

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