银杏叶提取物对db/db糖尿病小鼠胰岛功能的影响

刘春燕，张 珍，易秋艳，刘艳清，王昕怡，卢 斌，王英之杰，邵加庆

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

银杏叶提取物EGb761是目前国内外治疗缺血性心脑血管病中的常用药物，在对合并糖尿病的心脑血管疾病的临床和基础研究中，有学者发现EGb761能显著改善血糖水平［1-2］、保护胰岛 β 细胞［3］，这为糖尿病的治疗提供了一种新的治疗手段，但其防治糖尿病的机制尚未明确。本研究采用db/db小鼠，通过观察EGb761干预对胰岛分泌功能和胰岛内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶表达水平的影响，探讨EGb761改善糖尿病的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 选取10只8周龄清洁级雄性C57BL/KsJ-db/db小鼠［许可证号SCXX(苏)2007-0012］，体重约20～25 g，喂养于清洁屏障设施内，环境温度保持在23℃，12～12 h亮暗周期，自由摄取食物和饮水。动物的处置均遵循实验动物看护原则(NIH Publication No.85-23，修订于1985年)。

1.2 方法 将10只db/db小鼠随机分为观察组(EGb761组)、糖尿病对照组(db/db组)，每组各5只，分别给予8周的EGb761［GINATON(金纳多)，德国的施瓦伯制药集团］，100 mg/(kg·d)和安慰剂(5%阿拉伯胶)灌胃，另选取5只同周龄同窝出生的db/m小鼠作为非糖尿病对照组(db/m组)，给予安慰剂灌胃。

1.3 实验仪器、材料 血糖仪［One Touch Ultra，强生(中国)医疗器材有限公司］、血糖试纸(lifescan公司，美国)、光学显微镜(尼康 E800，日本)、豚鼠抗人胰岛素抗体(1∶2000，LINCO公司，美国)、山羊抗人 p22phox、gp91phox 抗体(1∶100，Santa Cruz生物技术公司，加拿大)、生物素化山羊抗豚鼠IgG抗体(1∶1000，Chemicon 公司，加拿大)、生物素化兔抗山羊IgS抗体(1∶200)与生物素化山羊抗小鼠IgS抗体(1∶200，Dako 公司，日本)。

1.4 检测指标

1.4.1 相关生理指标检测 每周监测小鼠体重和随机血糖，投药前和投药8周后测定空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FSI)、并计算葡萄糖和胰岛素曲线下面积及胰岛素敏感指数。并于投药8周后，每组的5只小鼠均行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)。用胰岛素曲线下面积(AUCFSI)评价胰岛分泌功能，以 0～30 min胰岛素曲线下面积(AUCFSI0-30)评价早期相的胰岛素分泌，计算公式为：AUCFSI0-30=FSI30-FSI0。

1.4.2 免疫组织化学测定 投药8周后，取小鼠胰腺固定、包埋、切片后利用抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)法检测胰岛素、NADPH氧化酶p22phox亚基、gp91phox亚基的表达，按药盒说明书操作。

1.4.3 胰岛测量分析 光学显微镜下观察切片并拍照，利用Axiovision 4.3软件获得数字照片后用Image-Pro Plus 5.0.1软件分析，胰岛中p22phox和gp91phox的表达强度分析参照操作说明书。胰岛β细胞含量测定使用胰岛素染色照片分析并用下述公式计算：胰岛β细胞含量(mg)=胰岛面积/胰腺面积×胰腺重量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，正态分布的计量数据以均数±标准差()表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，实验前后的资料比较用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生理指标 投药前，EGb761组和db/db组的体重、血糖无明显差异(P＞0.05)；投药8周后两组体重仍无显著差异，但EGb761组平均空腹血糖显著低于db/db组(P＜0.05)，且胰岛素敏感指数明显升高(P＜0.05，表1)。而db/m组投药前投药后各项指标均与EGb761组和db/db组有显著差异(P＜0.05)。

2.2 EGb761对糖耐量及胰腺分泌功能的影响 糖负荷前及负荷后60、120 min，EGb761组血糖较db/db组显著降低，且AUCFSI显著低于db/db组(P＜0.05，图1)。糖负荷后30 min EGb761组血浆胰岛素水平升高，且AUCFSI0-30显著高于db/db组(P＜0.05，表2、图2)，说明 EGb761对糖耐量的改善部分得益于胰岛β细胞早期相功能的改善。db/m组各项指标与EGb761组和db/db组亦有显著差异(P＜0.05)。

2.3 EGb761对胰岛质量的影响 与db/m组相比，db/db组的胰腺内胰岛素染色强度明显降低，提示胰岛质量的显著下降，而EGb761组的胰岛素染色强度、胰岛β细胞含量均显著高于db/db组，介于 db/m组和 db/db组之间(图 3、4)，表明了EGb761有效减轻了胰腺损伤导致的胰岛质量下降。

2.4 EGb761对胰腺内NADPH氧化酶表达的影响Gp91phox和 p22phox阳性区域出现在胰岛细胞的细胞质，半定量分析显示db/db组gp91phox和p22phox表达最强，EGb761治疗显著降低gp91phox和p22phox表达强度，并低至接近db/m组水平(P＜0.01，图5～8)，反映胰岛内氧化应激程度下降。

表1 投药前及投药8周后相关生理指标比较()

表1 投药前及投药8周后相关生理指标比较()

注：与db/db组比较，*P＜0.05

图1 葡萄糖耐量试验血糖曲线

表2 葡萄糖耐量试验中血糖和胰岛素曲线下面积()

表2 葡萄糖耐量试验中血糖和胰岛素曲线下面积()

注：与db/db组比较，*P＜0.05

图2 葡萄糖耐量试验胰岛素释放曲线

3 讨论

图3 胰腺胰岛素染色(ABC×400)

图4 胰岛组织胰岛β细胞含量

图5 胰岛组织p22phox染色显示(ABC×400)

图6 胰岛组织p22phox半定量显示

图7 胰岛组织gp91phox染色显示(ABC×400)

图8 胰岛组织gp91phox半定量显示

本研究所选取的15只小鼠是同窝出生的，根据实验要求，在进入本实验前其中的10只小鼠已被成功造模成糖尿病鼠(db/db小鼠)，另5只作为非糖尿病对照组(db/m组)也纳入本次实验中。在实验开始前把10只db/db小鼠随机分为两组，一组给予药物灌胃作为实验组(EGb761组)，另一组给予安慰剂灌胃作为糖尿病对照组(db/db组)，5只非糖尿病小鼠给予安慰剂灌胃作为非糖尿病对照组(db/m组)。分组的理论基础是观察db/m组与db/db组、EGb761组与db/db组、EGb761组与db/m组之间的体重、随机血糖、IPGTT、胰岛素敏感性、胰腺内NADPH氧化酶等各项指标变化，由此分析评估笔者所预计的实验结果以及EGb761可能的降糖机制。

Guzik等［4］研究发现NADPH氧化酶是血管生成活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的主要酶体，ROS可使细胞膜脂质过氧化、蛋白质变性、生物酶失活、核酸破坏，增强氧化应激等作用，本课题组前期研究证实ROS的过度蓄积不仅可以直接损伤胰岛β细胞，还可通过影响胰岛素合成和分泌的信号转导通路间接导致β细胞损伤凋亡，从而损害胰岛的分泌功能［5-10］。Gp91phox和p22phox是NADPH氧化酶复合体的膜结合亚基，被认为是NADPH氧化酶最主要的功能亚基，本研究利用免疫组化证实了gp91phox和p22phox在胰岛β细胞中的表达，db/db组的表达强度远超过db/m组，而EGb761治疗可显著降低NADPH氧化酶的表达，证明EGb761通过其强大的抗氧化、清除自由基能力降低小鼠血糖，改善胰岛素分泌功能和胰岛素敏感性，机制可能是通过降低氧化应激的上游因子如NADPH氧化酶gp91phox、p22phox亚基的表达水平而改善胰腺微环境，减轻氧化应激损伤，保护胰岛 β细胞。但EGb761改善糖尿病的具体机制尚未完全明确，仍需进一步加以研究。

银杏叶作为药物使用在中国已有很久的历史，其提取物EGb761作为一种公认的强抗氧化剂，已被证实不仅具有清除氧自由基、抑制NO的产生等作用，还能舒张血管平滑肌、降低外周血流阻力、增加局部血流量、改善心脑等器官血液循环［11-12］。Zhou等［13］证实银杏内酯可拮抗氧化损伤导致的细胞凋亡，并且可以在凋亡早期阻断其进程。Smith等［14］发现EGb761能够维持线粒体膜的完整性，减少线粒体细胞色素C的释放，而细胞色素C正是形成凋亡小体的关键分子。

近年来，随着研究的不断深入，糖尿病的治疗已经超越传统的促进胰岛素分泌以及减轻胰岛素抵抗上，针对性的抗炎、抗氧化已经成为糖尿病治疗的热点，EGb761、大黄酸［15］、鬼针草提取物［16］等都是近年来国内学者研究降糖机制的对象，中西医联手，“降”、“调”结合，优势互补不失为一条提高全人类健康的新途径。

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