反复冻融和超声协同作用破碎酵母细胞*

苑华宁，黄冬云，张晖，钱海峰，王立，齐希光

(江南大学食品学院，江苏 无锡，214122)

近年中国啤酒工业迅速发展，成为啤酒产量最大的国家，2012 年啤酒产量达到4 900 万kL，占全球产量的1 /4 。该行业的迅猛发展带来了大量的废弃酵母，啤酒酵母中含有大量的营养物质，50%左右的蛋白质，23% ～28%碳水化合物，6% ～8%核糖，2% B族维生素，1% 谷胱甘肽以及丰富的氨基酸、矿物质［1］，对酵母进行破碎，是综合利用酵母的一种有效途径。酵母细胞壁较厚，难以破碎［2-3］，目前破碎酵母细胞的方法主要有酶法破壁、化学法破壁、物理法破壁。酶法酶制剂较贵，酶解时间长;化学法对蛋白质的损伤较大，容易引起蛋白质变性;单一的物理方法(如微珠法、反复冻融法、高压匀浆法、超声波法)破壁效率低、能耗大［4-5］。

反复冻融法是较温和的破壁方法，可以避免高温对原料造成的营养损失、风味裂变等不良影响［6］。超声波破碎是一种有效的、温和的破碎细胞的方法，由于超声引起空穴，液体会形成小气泡，在气泡发生空穴的破碎期间，大量声能转化成机械能，引起剪切梯度使细胞发生破裂［4］，目前已广泛应用于微生物和植物细胞中核酸、蛋白质的提取［7-8］。啤酒酵母细胞壁厚难以破碎，要有效利用细胞中的营养成分必须对其进行破壁处理［9］，本研究以破壁率为指标，首次采用反复冻融法与超声破碎法协同破碎酵母细胞，旨在提高酵母的破壁率，为进一步综合利用酵母细胞提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

啤酒酵母，实验室保藏;葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司;酵母膏，国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨，国药集团化学试剂有限公司。

冷冻离心机，CR21GⅡ;超净工作台，苏净安泰二级生物安全柜BHC-1000ⅡA2;生物光学显微镜，Galen Ⅲ;超声细胞粉碎仪，南京新辰生物科技有限公司;激光粒度分析仪，美国Microtrac 公司S3500 ;恒温恒湿培养箱，SPX-150C 型;电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司AL104 ;pH 计DELTA320，上海分析仪器三厂;血球计数板，XB-K-25 血细胞计数板;高压蒸汽灭菌锅，YXQ-LS-SⅡ。

1.2 方法

1.2.1 酵母细胞培养

将酵母菌活化，接种于YPD 液体培养基中，在30℃、130 r/min 的培养箱中进行扩大培养20h，冷冻离心，灭菌去离子水洗涤3 次，离心取沉淀备用。

1.2.2 反复冻融法破壁参数的选择

以酵母细胞的破壁率为指标，考察加水量和冻融次数对破壁效果的影响。

1.2.2.1 加水量的影响

设计7 个处理，分别喷加5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%的无菌去离子水，慢速冷冻2 h，解冻1 h，如此反复冻融3 次。每个处理重复3 次。

1.2.2.2 冻融次数的影响

处理为喷加25%的无菌去离子水，分别冻融1、2、3、4、5、6 次，冻结2 h，解冻1 h，每个处理重复3 次。

1.2.2 超声波法破壁参数的选择

设定超声辐射时间间隔为15 s，于冰浴中对酵母细胞进行超声破碎。以破壁率为指标，考察超声功率、超声总时间、每次辐射时间、酵母浓度等因素对破壁效果的影响。

先进行单因素实验，找出这4 个因素的影响规律和优化范围。由于当功率达到500、600 W 时，超声产生的热效应很明显，有部分细胞发生炭化沉于底部，所以单因素试验的超声功率取400 W、超声总时间取15 min、每次辐射时间取10 s、酵母浓度取20 mg/mL。

为了得到酵母细胞破壁率与4 因素之间的量化关系，在单因素试验基础上，以酵母细胞破壁率为考察指标，以L9(34)正交表进行4 因素3 水平的正交试验。正交设计见表1。

表1 L9(34)正交因素水平表Tab.1 L9(34)level of orthogonal factors

1.2.3 反复冻融及超声波协同作用对酵母细胞破壁率的影响

将反复冻融与超声波破碎技术相结合，比较单独作用与协同作用条件下酵母细胞的破壁率。协同作用条件:加水量25%，慢速冷冻2 h、解冻1 h，反复冻融4 次，超声功率400 W，每次辐射时间11 s，超声总时间14.5 min，酵母浓度20 mg/mL。

1.2.4 破壁率的计算

采用活菌显微镜直接计数法，参照郭卫芸［6］等人处理方法进行活菌计数。

其中，α 为酵母细胞的破壁率;M 为破壁前的酵母菌细胞数;N 为破壁后的酵母菌细胞数。

1.2.5 酵母细胞形态的观察

采用日立S-4800 扫描电子显微镜(SEM)进行观察。测试样品参照孙镇平［10］等人的高倍扫描预处理改进方法进行处理。

1.2.6 酵母粒度检测

利用激光粒度分析仪对破碎前后的酵母溶液进行粒度分布测试。

1.2.7 数据分析

数据统计采用SPSS17.0 进行单因素方差分析及LSD 多重检验(P ＜0.05)，数值以均值± 标准差表示。

2 结果与分析

2.1 反复冻融法对酵母细胞破壁率的影响

2.1.1 加水量的影响

由图1 可以看出酵母细胞的破壁率随着加水量的增大呈现先增大后平缓的趋势。在加水量为25%时破壁率达到了29.25%，加水量大于25%时，破壁率变化很小，可见加水量为25%时酵母细胞间隙几乎被水分填充满，使得反复冻融对酵母细胞的机械破坏作用几乎达到最大。这与郭卫芸［6］等人有关文献报道相比稍有提高，可能与酵母菌种、冻融解冻速度条件有关。

图1 加水量对酵母细胞破壁效果的影响Fig.1 Effect of water on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.1.2 冻融次数的影响

由图2 可以看出，酵母细胞的破壁率随着冻融次数的增加而增加。冻融次数低于2 次时，破壁率较小，增加不是很明显，这可能是由于破壁率小不易观察。当反复冻融超过3 次时，破壁率超过了30%，这可能由于冰晶的反复作用使得细胞破裂容易观察。当冻融4 次以后，破壁率增加趋于平缓。

图2 冻融次数对酵母细胞破壁效果的影响Fig.2 Effect of freezing and thawing times on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2 超声场对酵母细胞破壁率的影响

2.2.1 超声功率的影响

超声功率和频率是影响超声场强度的主要因素，当频率不变，功率较低时超声依靠机械效应和稳态空化效应使传质边界层减薄，一定程度上使粒子运动加速［11］，超声功率增加时超声在液体中的作用主要是通过激烈而短暂的瞬态空化效应完成的，高强度超声产生的空化效应比低强度超声时强得多，因此，功率越大超声破碎程度越大［4］。由图3 可以看出，随着超声功率的增大，酵母细胞的破壁率先增加后趋于平缓。当功率达到500、600W 时，超声产生的热效应很明显，有部分细胞发生炭化沉于底部，因此选用的超声功率为400W。

图3 超声功率对酵母细胞破壁效果的影响Fig.3 Effect of power on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.2 超声总时间的影响

由图4 可以看出，随着超声总时间的延长，酵母细胞的破壁率逐渐增加。这主要是由于能量具有累积效应，随着超声时间的延长，超声稳流振荡及空化效应积累越多，有利于酵母细胞的破碎。然而，能量的不断积累［12］，可引起超声波的化学效应，即能量能将溶出的大分子打断或使其变性，所以并非时间越长越好。综合考虑，选取超声的总时间为15 min。

图4 超声总时间对酵母细胞破壁效果的影响Fig.4 Effect of total time on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.3 每次辐射时间的影响

由图5 可看出，酵母细胞的破壁率随着每次超声辐射时间的增加呈现先增加后基本不变的趋势，当每次辐射时间达到10 s 时，破壁率达到最大，此后基本不变。超声波的空化效应需要一定的时间来完成［11］，每次辐射时间较短，超声空化时的机械效应较低，细胞壁破坏较少;当辐射时间达到10 s 时，空化效应产生的机械作用使得酵母细胞细胞壁破裂。

图5 每次辐射时间对破壁效果的影响Fig.5 Effect of ultrasound duration of irradiation each time on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.4 酵母浓度的影响

由图6 可以看出，随着菌体浓度的增加酵母细胞的破壁率呈现先增大后减小的趋势。在浓度为20 mg/mL 时破壁率达到61.45%，此后随着菌体浓度的增大，破壁率逐渐减小。由此可以推测，合理的酵母细胞浓度可以有效提高超声破壁的效率，选取菌体浓度为20 mg/mL。

图6 菌体浓度对酵母细胞破壁效果的影响Fig.6 Effect of yeast concentration on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.5 正交试验结果

正交试验结果如表2 所示，以表3 的方差分析为依据，选取超声总时间作为误差估计项，研究结果表明，B(超声功率)和D(酵母菌浓度)对酵母细胞的破壁效果有显著影响(P ＜0.05)。由极差分析可以看出影响酵母菌破壁效果的各种因素的主次关系为B(功率)＞D(菌体浓度)＞A(每次辐射时间)＞C(超声总时间)。正交试验结果结合K 值可知最佳破壁条件为B2D2A3C1，即超声功率400W，每次辐射时间11 s，超声总时间14.5 min，酵母浓度20 mg/mL。

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3 反复冻融及超声波协同作用对酵母细胞破壁率的影响

由表4 可看出，利用反复冻融与超声破碎协同作用可使酵母细胞的破壁率达到89.31%，是反复冻融4 次单独作用的2.4 倍，是超声破碎单独作用的1.5倍。刘晓永［13］等人的研究表明，研磨法的破壁率只有10.03%，超声波法对酿酒酵母的破壁率只有76.36%，不能满足研究的需要，珠磨机法的破壁效果良好，但设备需进口，较为昂贵。孙海翔［14］等人的研究表明，高压均质法和高速分散法的破壁率在50% ～70%。反复冻融与超声波协同作用破碎酵母细胞操作简单、破壁率高，综合比较发现协同作用是破碎酵母细胞的一种高效的方法。

2.4 酵母细胞形态结构的观察

采用扫描电子显微镜(SEM)对破壁前后的酵母菌形态进行观察，放大倍数为5.00K 时的图像如图7所示。从图7 可以看出，破壁前酵母菌的形态比较完好，呈现颗粒状的形态，经过破壁处理后大部分酵母菌细胞破裂，形态结构被破坏，呈现碎片的形态。

表4 3 种不同处理方法对酵母细胞破壁率的影响Table 4 Effect of three different treatment methods on the broken ratio of brewer yeast cell walls

图7 破壁前后酵母菌的形态Fig.7 The morphology of yeast cells

2.5 酵母细胞粒度分布

由图8 可以看出3 种方法处理前后酵母溶液的粒度分布的变化情况。破壁前酵母溶液的粒度分布如图a 所示，该啤酒酵母的粒度分布比较窄，其中d0.1= 4.3 μm，d0.5=5.59 μm，d0.9=9.45 μm。反复冻融处理后酵母溶液的粒度分布如图b 所示，经冻融后酵母溶液中约1/3 的酵母破碎，小颗粒的溶度有所增加，溶液颗粒分布变宽，其中d0.1= 0.076 μm，d0.5=2.713 μm，d0.9=4.47 μm。超声破碎后酵母溶液粒度分布如图c 所示，与b 图相比小颗粒的浓度更大，说明破壁率比反复冻融的高，约3/5 的酵母破碎，破碎后的颗粒更小，其中d0.1= 0.049 μm，d0.5=2.144 μm，d0.9=4.21 μm。反复冻融和超声破碎协同处理后酵母溶液的粒度分布如图d 所示，超过4/5的酵母细胞被破碎，与其他2 种处理方法相比，破壁后溶液中的小颗粒分布更宽，其中d0.1=0.013 10 μm，d0.5=0.025 00 μm，d0.9=3.67 μm，说明绝大多数的酵母破壁成为碎片，协同处理破碎酵母的效率更高。

图8 酵母溶液的粒度分布Fig.8 The particle size distribution of yeast solution

3 结论

反复冻融和超声破碎协同作用是破碎啤酒酵母细胞的一种高效、温和的处理的方法，该法能够保持大分子物质的活性，为进一步综合利用啤酒废酵母提供了参考。通过试验可以发现，反复冻融处理时，在加水量为25%、冻融4 次时破壁率达到37.75%;超声破碎时，在超声功率400W，每次辐射时间11 s，超声总时间14.5 min，酵母浓度20 mg/ml 时破壁率达到61.45%;反复冻融和超声协同处理后，酵母溶液的破壁率达到了89.31%，是反复冻融4 次单独作用的2.4 倍，是超声破碎单独作用的1.5 倍。因此反复冻融和超声波协同作用，是破碎啤酒酵母细胞壁的一种高效方法。

［1］ 吴润桥，杨振扬，张秀廷，等. 啤酒废酵母综合破壁法提取酵母味素技术［J］. 酿酒科技，2007，(11):95 -96.

［2］ Dan Liu ，Xin-An Zeng ，Da-Wen Sun ，et al. Disruption and protein release by ultrasonication of yeast cells［J］.Innovative Food Science ＆ Emerging Technologies，2013，18:132 -137.

［3］ Frans M Klis ，Pieternella Mol ，Klass Hellingwerf ，et al.Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae［J］. FEMS Microbiology Reviews，2002，26(3):239 -256.

［4］ 谢阁，杨瑞金，陆蓉蓉. 高压脉冲电场和超声波协同作用破碎啤酒废酵母的研究［J］. 食品科学，2008，29(7):133 -137.

［5］ 韩玉珠，殷勇光，丁宏伟. 高压脉冲电场对啤酒酵母细胞溶解释放蛋白质的影响［J］. 吉林农业大学学报，2006，28(1):24 -26.

［6］ 郭卫芸、杜冰、袁根良，等. 反复冻融法破碎啤酒酵母细胞壁的研究［J］. 酿酒科技，2009(3):103 -105.

［7］ Wenjian Yang ，Yong Fang ，Jin Liang，et al. Optimization of ultrasonic extraction of Flammulina velutipes polysaccharides and evaluation of its acetylcholinesterase inhibitory activity［J］.Food Research International，2011，44(5):1 269 -1 275.

［8］ Yasuo Lida ，Toru Tuziuti ，Kyuichi Yasui ，et al. Protein release from yeast cells as an evaluation method of physical effects in ultrasonic field［J］. Ultrason Sonochem，2008，15(6):995 -1 000.

［9］ 戴宁，张裕中，周东. 超高压均质参数对酵母破壁率的影响［J］. 食品与发酵工业，2011，37(9):109 -113.

［10］ 孙镇平，李佳，刘洪红，等. 不同处理技术对环境扫描电镜下细菌原始形态的影响［J］. 扬州大学学报，2013，34(1):41 -43.

［11］ 李春喜，宋红艳，王子镐. 超声波在化工中的应用与研究进展［J］. 石油学报，2001，17(3):86 -94.

［12］ 李延盛，伊其光. 超生化学［M］. 北京:科学出版社，1995.

［13］ 孙海翔，尹卓容，马美范. 高压均质破碎啤酒酵母细胞壁的研究［J］. 食品工业科技，2002，23(2):66 -67.

［14］ 刘晓永，王强，胡永金. 用微珠涡流法破壁酵母细胞［J］. 吉首大学学报，2006，27(6):110 -113.