4种鱼肉羟脯氨酸含量的测定

张延华，马国红，王爱英，王秉利，许 鹏 （山东省淡水水产研究所，山东济南250117）

胶原蛋白又称胶原，是动物体内结缔组织的重要组成成分，约占其体内总蛋白质含量的1／4［1］。胶原蛋白含有丰富的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸。羟脯氨酸 （Hydroxyproline，Hyp）是胶原蛋白的特征性氨基酸，通过测定羟脯氨酸的含量，然后乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的含量。羟脯氨酸的测定包括比色法、氨基酸分析仪法和HPLC法、电泳法等，以比色法最为常用［2］。

提取胶原蛋白的传统原料主要是陆生哺乳动物，如猪、牛的皮和骨。由于近年来哺乳动物疫病的爆发和人畜共患病的增加，世界各国都在积极寻找新的胶原蛋白来源，同时渔业养殖的大规模发展使水产胶原蛋白替代哺乳动物成为可能。不少学者对鱼类组织中的羟脯氨酸进行测定，以为寻找新的胶原蛋白原料提供理论依据。张俊杰等［3］曾用比色法测定鱼鳞中羟脯氨酸，胡建平［4］对鱼骨中的羟脯氨酸进行过测定，鱼皮中的羟脯氨酸含量也有过报道，但鱼肉中羟脯氨酸的含量却鲜有报道。本研究选取草鱼（Ctencpharyngodon idellus）、鲤鱼 （Cyprinus carpio）、鳙鱼 （Aristichthys mobilis）、罗非鱼 （Oreochromis mossambicus）作为研究对象，对其鱼肉中的羟脯氨酸含量用比色法进行测定，以期为鱼肉的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

草鱼、鲤鱼、鳙鱼、罗非鱼均购自济南市某水产品市场，鱼体健康无病，体重1kg左右，冰块保存运至实验室，每尾鱼分别取背部的肌肉。由于受生长环境、营养条件、鱼体大小等因素的影响，鱼体不同部位肌肉所测得的结果会有差异。就同种鱼类来说，鱼体背部肌肉的营养成分相对比较稳定。为了便于取样与比较，本研究中的采样统一取背部肌肉即自鱼体两侧鳃盖骨后至尾鳍前取体背部肌肉作为样品进行测定。用刀将鱼肉在冷冻时 （0℃以下）切成小块 （约0.5cm3，边长约为8mm），置于－20℃冰箱保存备用。其中一部分用于常规营养成分测定，一部分用于羟脯氨酸的测定。

1.2 常规营养成分测定

水分含量测定采用105℃烘干失水法［5］，粗蛋白含量测定采用微量凯式定氮仪法［6］，粗脂肪含量测定采用索氏抽提法［7］，灰分含量测定采用550℃干法灰化法［8］。

1.3 羟脯氨酸含量的测定

4种鱼肌肉样品的羟脯氨酸含量测定方法参照GB／T 9695.23－2008／ISO 3496：1994［9］略作修改。

1.3.1 标准曲线制作

按文献 ［9］的方法分别制得浓度依次为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg／ml的标准工作液。再分别移取4.00ml羟脯氨酸标准工作液于比色管中，加入2.00ml氯胺试剂，混合后于室温下放置 （20±1）min。加入2.00ml显色剂于比色管中，充分混合，用塑料薄膜将比色管封口，迅速放入60℃水浴中，保温20min。取出比色管，用流动水冷却比色管至少3min，在室温下放置30min。用水作参比，于（558±2）nm处用分光光度计测定光密度值。以扣除了空白的标准工作液的光密度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 测定步骤

将切好的试样装入耐热塑料袋中，70℃以上保温30min后，冷却。用绞肉机将试样均质。称取4g试样 （精确至0.001g）于烧瓶中，避免试样粘在烧瓶壁上。量取 （30±1）ml硫酸溶液，加入烧瓶中，用表面皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。用圆形滤纸趁热将水解产物过滤至250ml容量瓶中。用10ml硫酸溶液分3次洗涤烧瓶和滤纸，合并至上述容量瓶中。用水定容，摇匀。

用移液管移取一定体积 （V）的水解产物至250ml容量瓶中，定容后羟脯氨酸的浓度在0.5～2μg／ml之间。移取4.00ml上述溶液于比色管中，加入2.00ml氯胺试剂，混合后于室温下放置（20±1）min。按1.3.1所述步骤与方法，用水作参比，于 （558±2）nm处用分光光度计测定光密度值。

1.3.3 羟脯氨酸含量计算

扣除空白溶液的吸收，从所得标准曲线查得水解产物中羟脯氨酸的含量。试样中羟脯氨酸的含量按下式计算：

式中：X为试样中羟脯氨酸的含量，%；c为由标准曲线得到的试样溶液中羟脯氨酸的浓度，μg／ml；m为试样质量，g；V为从250ml容量瓶中吸取滤液的体积，ml。

2 结果与分析

2.1 常规营养成分含量

4种鱼肌肉基本营养成分测定结果见表1。由表1可以看出，4种鱼肌肉中都含有大量的水分，其中鳙鱼、罗非鱼都在80g／100g以上；草鱼、鲤鱼、鳙鱼、罗非鱼4种鱼肌肉中干物质 分 别 占 21.23%、25.68%、18.58% 和19.13%，这些干物质中大部分为蛋白质，其蛋白质含量分别占4种鱼肌肉干物质总量的76.22%、66.48%、83.66%和85.43%，其大小顺序为罗非鱼＞鳙鱼＞草鱼＞鲤鱼。因此，仅从蛋白质含量来说，鱼肉是一种优良的蛋白质来源。4种鱼肉中鲤鱼的脂肪含量最高，草鱼次之，鳙鱼、罗非鱼最低。4种鱼灰分含量相差不大。

表1 4种鱼肌肉基本营养成分（鲜样） g／100g

2.2 羟脯氨酸标准曲线的绘制

以羟脯氨酸浓度 （μg／ml）为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线 （图1），计算得其回归方程为：y＝0.1692x＋0.0018，相关系数R2＝0.9856，可见，光密度和羟脯氨酸浓度之间有很好的相关性。

2.3 肉样羟脯氨酸含量

4种鱼肌肉样品的羟脯氨酸含量测定与计算结果见表2。

图1 羟脯氨酸标准曲线

表2 4种鱼肉中羟脯氨酸含量

由表2可知，草鱼、鲤鱼、鳙鱼、罗非鱼鱼肉中羟脯氨酸平均含量分别为0.0781、0.0743、0.0725、0.0724g／100g。

3 小结

本试验结果表明，草鱼、鲤鱼、鳙鱼、罗非鱼的鱼肉中羟脯氨酸分别为0.0781、0.0743、0.0725、0.0724g／100g，含量相差不大。这与文献报道的鱼皮中羟脯氨酸含量罗非鱼皮 （1.86%）、金枪鱼皮（2.04%）［10］相比，淡水鱼肉中的羟脯氨酸含量均较低。

［1］张其清，王彭延，朱明华，等.胶原材料的生物学评价 ［J］.生物医学工程学杂志，1989，6（3）：216－218.

［2］张自强，赵东旭，杨新林.羟脯氨酸的研究与开发 ［J］.氨基酸和生物资源，2006，28（1）：55－58.

［3］张俊杰，曾庆孝.鱼鳞中羟脯氨酸的测定 ［J］.淮海工学院学报 （自然科学版），2004，13（1）：53－55.

［4］胡建平.鱼骨胶原蛋白的黏度特性研究 ［J］.食品与发酵科技，2006，45（6）：36－44.

［5］GB 5009.3－2010食品安全国家标准食品中水分的测定 ［S］.

［6］GB／T 6432－94饲料中粗蛋白测定方法 ［S］.

［7］GB／T 6438－92饲料粗灰分的测定 ［S］.

［8］GB／T 5009.6－2003食品中脂肪的测定 ［S］.

［9］GB／T 9695.23－2008／ISO 3496：1994肉与肉制品羟脯氨酸含量测定 ［S］.

［10］杨树奇，曾少葵，周春霞，等.3种鱼皮的基本成分及氨基酸组成分析 ［J］.广东海洋大学学报，2010，30（1）：97－100.