HPLC法测定阿托伐他汀钙3种中间体的含量和有关物质

张明颖，孙国祥（沈阳药科大学药学院，沈阳110016）

阿托伐他汀钙是羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂类调血脂药，可降低血清胆固醇和甘油三酯水平，副作用小，临床用于治疗多种高胆固醇血症和混合性脂代谢紊乱症[1]。阿托伐他汀钙原料药在合成过程中的中间体有4-氟苯基苄基酮（FPAP）、4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺（M-2）和（4R-cis）-6-[2-[2-（4-氟苯基）-5-（1-异丙基）-3-苯基-4-[（苯胺）羰基]-1H-吡咯-1-基]乙基]-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯（L-1）[2-4]，3种中间体的化学结构式见图1。

图1 3种中间体的化学结构Fig1 Chemical structures of 3 intermediates

为控制该原料药质量，笔者参照有关文献[5-11]采用高效液相色谱（HPLC）法对FPAP、M-2和L-1这3种中间体进行含量测定和有关物质检查，制定3种中间体的合适的质量限度以保证阿托伐他汀钙产品的质量合格。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100型HPLC仪，配有二极管阵列检测器（DAD）、四元低压梯度泵和自动进样器、ChemStation工作站（美国Agilent科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

FPAP、M-2、L-1对照品（批号：091025、091026、091027，纯度：99.7%、99.1%、99.8%）与FPAP、M-2和L-1样品（各3批，批号均为：20100101、20100102、20100103，纯度：均＞98.0%）均为自制；甲醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，枸橼酸为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液。精密称取FPAP、M-2和L-1对照品适量，分别使用乙腈-50 mmol/L枸橼酸铵溶液（pH7.4）（1∶1，V/V）、甲醇-水（80∶20，V/V）和甲醇为配样溶液制成质量浓度分别为20、50、50 μg/ml的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液。精密称取FPAP、M-2和L-1样品适量（分别约10、25、25 mg），置于50 ml量瓶中，分别取“2.1.1”项下配样溶液溶解并定容，摇匀，过滤；取续滤液适量用配样溶液制备成质量浓度分别为20、50、50 μg/ml的供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

测定3种中间体的色谱柱和流动相组成条件见表1。

表1 测定3种中间体的色谱条件和理论板数Tab1 Chromatographic conditions and theory plate number of 3 intermediates

其余条件为：流动相流速为1.0 ml/min，柱温为（30±0.15）℃，检测波长为244 nm，进样量为20 μl。精密吸取3种中间体对照品溶液在相应色谱条件下进样测定，理论板数结果见表1，表明本色谱条件适用性良好。

2.3 方法专属性考察

分别取3种中间体各自的配样溶液、对照品溶液和供试品溶液进样测定，结果表明配样溶液不干扰中间体的含量测定，色谱图见图2。

图2 3种中间体的高效液相色谱图A.FPAP；B.M-2；C.L-1；a.配样溶液；b.供试品；c.对照品Fig2 HPLC chromatograms of 3 intermediatesA.FPAP；B.M-2；C.L-1；a.blank solvent；b.test sample；c.substance control

另取3种中间体供试品溶液分别在酸、碱、氧化、高温和光照条件下进行破坏试验，结果表明主成分峰与各降解产物能达到很好的分离。

2.4 线性关系考察

精密称取FPAP、M-2、L-1对照品各10 mg，置于50 ml量瓶中，各自加入相应的配样溶液溶解并定容，摇匀，作为贮备液。精密量取各贮备液适量用配样溶液按表2制备成系列质量浓度的标准溶液。分别精密吸取5种系列质量浓度的标准溶液各20 μl，在选定的色谱条件下进样测定2次，记录色谱图，以平均峰面积（A）对质量浓度（c）进行回归得到3种中间体的线性方程；调整对照品溶液的质量浓度按3倍信噪比确定检测限，按10倍信噪比确定定量限，结果见表2。

2.5 进样精密度、稳定性、重复性和回收率试验

精密称取FPAP、M-2和L-1对照品按“2.1.1”项下方法制成3种中间体的对照品溶液，分别精密吸取3种中间体对照品溶液连续进样分析5次以考察精密度；FPAP对照品溶液分别在0、2、4、5、6 h进样测定，M-2和L-1对照品溶液分别在0、1、3、5、7 h进样测定以考察稳定性；按供试品溶液质量浓度的80%、100%、120%分别制备3种中间体的对照品溶液，各浓度制备3份，每份测定2次以考察回收率；重复制备5份供试品溶液分别测定以考察重复性。各项试验结果表明FPAP供试品溶液在6 h内稳定，M-2和L-1供试品溶液在7 h内稳定；3种中间体的精密度、准确度、重复性及样品稳定性均合格，详见表3。

表2 3种中间体的线性方程、相关系数、检测限和定量限Tab2 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 3 intermediates

表3 3种中间体的精密度、稳定性、重复性和回收率结果（%%）Tab3 Precision，stability，repeatability and average recovery of 3 intermediates（%%）

2.6 样品含量测定

分别精密吸取3种中间体供试品溶液测定2次，以平均峰面积按标准曲线计算3种中间体各3批样品的含量。结果，FPAP 3批样品中FPAP含量分别为98.54%、98.48%、98.77%（≥98%）；M-2 3批样品中M-2含量分别为98.69%、99.38%、99.13%（≥98%）；L-1 3批样品中L-1的含量分别为99.13%、99.77%、99.11%（≥99%）。根据试验结果规定FPAP、M-2和L-1 3种中间体的含量应分别不低于98%、98%和99%。

2.7 样品中有关物质测定

2.7.1 溶液制备。供试溶液制备：取FPAP、M-2和L-1样品适量以各自的配样溶液制成质量浓度分别为200、500、500µg/ml的供试溶液。对照溶液制备：精密吸取上述1 ml供试溶液，置于100 ml量瓶中，分别加配样溶液溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.7.2 有关物质测定。分别吸取3种中间体的供试溶液进样测定，记录色谱图至主峰保留时间的3倍，再吸取对照溶液进样测定，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的20%，记录色谱图。按主成分自身对照法计算3种中间体中有关物质的含量，结果3批FPAP样品中的有关物质分别为0.27%、0.28%、0.28%（＜0.5%），3批M-1样品中的有关物质分别为0.86%、0.95%、0.92%（＜1%），3批L-1样品中有关物质分别为0.16%、0.18%、0.15%（＜0.5%）。根据试验结果规定FPAP、M-2和L-1 3种中间体的有关物质应分别小于＜0.5%、1%、0.5%。色谱图见图3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

中间体FPAP、M-2和L-1经紫外扫描最大吸收波长分别为244、243和240 nm。用相应的色谱条件对波长进行考察，结果发现3种中间体在244 nm波长处均有最大吸收，而且在此波长下由破坏试验所产生的降解产物均能被灵敏地检测出，故检测波长定为244 nm。

图3 3种中间体有关物质测定的高效液相色谱图Fig3 HPLC chromatograms of related substances of 3 intermediates

3.2 流动相及配样溶液的选择

笔者对中间体FPAP的流动相进行筛选，发现在阿托伐他汀钙原料药的色谱条件下可以实现FPAP与其有关物质的有效分离，为了后续的相关研究，故采用乙腈-四氢呋喃-枸橼酸铵体系作为FPAP的流动相，并采用乙腈-枸橼酸铵为配样溶液。

对中间体M-2和L-1的流动相进行筛选考察时，发现原料药的色谱条件不能使二者与有其关物质有效分离，因为M-2和L-1均易溶于甲醇，考虑到毒性及成本的因素故采用甲醇-水体系考察二者的流动相组成。结果发现，当M-2的流动相甲醇-水比例为60∶40时主峰与有关物质分离良好，在此基础上提高有机相比例主峰峰形变宽，降低有机相比例主峰峰形不佳且分离度下降；向流动相中加入磷酸盐后可明显改善主峰拖尾现象，可能是因为磷酸盐对色谱柱的羟基有改性作用并且可以调节流动相的pH值使M-2与其有关物质分离度提高；另因为溶解性效应M-2峰形有前沿现象，向配样溶液甲醇中加入20%的水可以有效改善主峰前沿。因此M-2流动相选用甲醇-50 mmol/L磷酸二氢钠溶液（60∶40），配样溶液选用甲醇-水（80∶20）。中间体L-1的流动相甲醇-水比例为85∶15时主峰与其有关物质能有效分离且峰形较好，若减少有机相比例则主峰峰形变宽且与有关物质的分离度降低，故L-1流动相选用甲醇-水（85∶15），配样溶液选用甲醇。

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀钙3种中间体FPAP、M-2和L-1的含量测定方法和有关物质检查方法，结果表明所建立的方法简单、准确、重复性好，可用于阿托伐他汀钙3种中间体的质量控制。控制好3种中间体的质量是确保阿托伐他汀钙有关物质含量低和产品纯度高的必要前提。本研究对于阿托伐他汀钙原料药生产过程的控制具有较重要的意义。

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