LC-MS/MS法测定大鼠血浆中维拉帕米与其代谢产物去甲维拉帕米的浓度及其药动学研究

郑侠，刘昌辉，王宁生，宓穗卿（.广州中医药大学临床药理研究所，广州50405；2.广东省医学实验动物中心，广东佛山 528248）

维拉帕米（Verapamil，Ver）属于第1代苯基烷胺类钙离子通道拮抗药，临床上被广泛应用于治疗心律失常、高血压、缺血性心脏病以及肥厚性心肌病等。近年Ver在阵发性室上性心动过速方面研究也有报道[1-2]。Ver口服给药后吸收迅速，首关代谢强，生物利用度低（10%～20%）[3]。去甲维拉帕米（Norverapamil，Nor）是Ver的主要代谢产物之一，其主要由细胞色素P450（CYP）3A4酶代谢[4]。笔者建立一种快速、灵敏、简便、取样量少的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法检测Ver与Nor在大鼠体内的血药浓度，旨在为临床进行药动学研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

API4000型LC-MS/MS仪，包括电喷雾离子源（ESI）、数据处理系统（美国AB公司）；1200型液相色谱系统（美国Agilent公司）。

1.2 药品与试剂

Ver对照品（批号：V4629，纯度：＞98%）、Nor对照品（批号：V108-20MG，纯度：＞98%）和他莫昔芬对照品（内标，批号：T5648，纯度：＞99%）均购于美国Sigma公司；甲醇、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD大鼠6只，♂，体质量（280±30）g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCKX（粤）2008-0002。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

精密称取Ver、Nor和内标对照品各10 mg，分别置于10 ml量瓶中，加5 ml甲醇使其溶解，用甲醇定容至10 ml，得1 mg/ml的母液，用时用甲醇稀释至所需质量浓度即可。

2.2 色谱条件与质谱条件

色谱柱：Alltima-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm），保护柱：Alltima-C18；流动相：甲醇-0.05%甲酸水（梯度洗脱，具体程序：0～0.1 min为0→45%甲醇，0.1～0.6 min为45%甲醇，0.6～1.1 min为45%→98%甲醇，1.1～7.3 min为98%甲醇，7.3～8.3 min为98%→45%甲醇，8.3～14.5 min为45%甲醇），流速：0.3 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μl。

ESI源；检测方式：正离子检测；扫描方式：多反应离子监测（MRM）；Ver、Nor和他莫昔芬的选择检测离子质荷比（m/z）分别为 455.3/165.0（[M+1]+）、441.0/165.0（[M+1]+）、372.2/129.1（[M+1]+）；雾化气流速：30 L/min；干燥气流速：30 L/min；干燥气温度：400℃；检测器电压：4 500 V。

2.3 血浆样品的采集与处理

2.3.1 血浆样品的采集：取大鼠6只，实验前12 h禁食不禁水，参照文献[5]拟定药动学研究方案，灌胃给药Ver 10 mg/kg，于给药前和给药后0.17、0.25、0.5、1、2，3、4、6、8、12、24 h眼眶静脉丛采血100 μl，置于1.5 ml肝素化的塑料管中，于4 ℃、1 500×g离心10 min分离血浆，置于－80℃冷冻贮存备用。

2.3.2 血浆样品的处理：取血浆20 μl，加入1 μg/ml内标对照品溶液5 μl，涡旋振荡30 s，加入甲醇100 μl，涡旋振荡3 min，16 000×g离心10 min，取上清液5 μl进样测定。

2.4 方法专属性考察

取大鼠空白血浆、空白血浆+Ver+Nor+内标、血浆样品（给药后2 h）+内标，依法处理后进样测定。结果显示，空白血浆对检测无干扰，Ver、Nor和内标的保留时间分别为5.78、5.77、6.77 min。色谱图见图1。

图1 液相色谱-串联质谱图A.空白血浆；B.空白血浆+Ver+Nor+内标；C.血浆样品+内标Fig1 LC-MS/MS chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+Ver+Nor+internal standard；C.plasma sample+internal standard

2.5 线性关系与最低检测限考察

取空白血浆20 μl，加入一定质量浓度的Ver、Nor对照品溶液 5 μl，制成Ver、Nor均为2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/ml的血浆样品，按“2.3.2”项下方法处理，进样测定。以Ver、Nor质量浓度（c）为横坐标，Ver、Nor分别与内标的峰面积之比（Y）为纵坐标，进行线性回归。得Ver、Nor的回归方程分别为：Y＝20.539c－0.940 4（r＝0.999 4）、Y＝47.789c+0.503 9（r＝0.999 2），二者检测质量浓度的线性范围均为2～1 000 ng/ml，最低检测限均为0.5 ng/ml（信噪比＞3）。

2.6 回收率与精密度试验

取空白血浆20 μl，制备成Ver、Nor质量浓度分别为5、50、500 ng/ml的血浆样品，按“2.3.2”项下方法处理，进行5样本分析，连续测定3 d，根据当日标准曲线计算样品质量浓度，分别计算绝对回收率、相对回收率、日内RSD、日间RSD，结果见表1。

表1 回收率与精密度试验结果（n＝5）Tab 1Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.7 稳定性考察

取大鼠空白血浆20 μl，制备成Ver、Nor质量浓度分别为5、50、500 ng/ml的血浆样品，室温放置28 d（测定时间为放置1、7、14、21、28 d）及－80℃反复冻融5次（测定时间为冻融后2、4、6、8、10 h），于相应测定时间测定Ver与Nor的质量浓度。结果，3个质量浓度血浆样品中Ver与Nor的RSD均＜5%，表明Ver与Nor在室温放置及反复冻融条件下均稳定。

2.8 药动学实验

取“2.3.1”项下各时间点的血浆样品，处理后进样测定Ver与Nor的血药浓度，绘制药-时曲线。用3p97软件计算药动学参数。Ver和Nor在大鼠体内的药-时曲线见图2，药动学参数见表2。

图2 Ver和Nor在大鼠体内的药-时曲线（n＝6）Fig2 Plasma concentration-time profiles of Ver and Nor in rats（n＝6）

表2 Ver和Nor在大鼠体内的药动学参数（±s，n＝6）Tab2 Pharmacokinetic parameters of Ver and Nor in rats（±s，n＝6）

表2 Ver和Nor在大鼠体内的药动学参数（±s，n＝6）Tab2 Pharmacokinetic parameters of Ver and Nor in rats（±s，n＝6）

参数Ke，/h t1/2，h tmax，h cmax，ng/ml AUC0-24 h，ng·h/ml AUC0-∞，ng·h/ml Ver 0.307±0.014 2.26±0.31 0.48±0.23 669.91±80.99 1 320.78±165.04 1 331.33±165.20 Nor 0.286±0.029 2.44±0.29 1.26±0.47 681.86±79.79 2 179.68±275.99 2 341.66±201.20

由上述结果表明，Ver和Nor在大鼠体内的药动学符合二房室模型。

3 讨论

Ver药动学研究在国内已有相关报道[6-7]，但采用LC-MS/MS同时测定Ver及其代谢产物Nor在大鼠体内血药浓度的方法在国内尚未见文献报道。本文建立的方法，每个样本仅需血浆100 μl，整个药动学研究过程采血量少，一只大鼠可完成一条完整的药-时曲线，且在整个采血过程中大鼠的状态比较好，这样就能更真实地反映Ver在大鼠体内的药动学过程。

在建立LC-MS/MS法的预实验中，笔者曾选用等度洗脱，洗脱时间为5 min，但是峰形较差、响应值不高。通过调节pH、流速和流动相比例，峰形、响应值都有所改善，但效果不是很理想。而采用梯度洗脱，虽然分析时间延长了，但峰形和响应值都有了很大改善。等度洗脱时，Ver、Nor和内标的半峰宽分别是0.4、0.4、0.5 min；而梯度洗脱时，Ver、Nor和内标的半峰宽分别是0.1、0.1、0.3 min，大大提高了检测的灵敏度。本研究建立的方法可为临床上Ver的药动学研究提供可靠的参考。

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