2型糖尿病患者外周血浆中热休克蛋白70抗体的变化

戚筠 杨杨

（武汉科技大学附属天佑医院内分泌科，湖北武汉 430064）

目前研究认为，2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）的发生和发展是遗传因素和环境因素共同作用的结果，其中氧化应激是T2DM发病的核心因素。热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）在应激状态下高度表达，它可参与免疫反应，具有抗细胞凋亡、抗氧化功能，而且可以提高细胞的应激耐受性，故可保护胰岛β细胞在应激状态时免遭损害。本研究旨在通过对T2DM患者外周血浆中HSP70抗体水平的检测，进一步了解HSP70及其抗体与T2DM的关系。

1 资料与方法

1．1 一般资料 2009年1月—2010年12月在我院确诊为T2DM的112例患者为T2DM组，年龄35～65岁，平均年龄（54．15±11．81）岁；男性65例，女性57例。选取同时间段在我院体检的110例健康人为对照组，年龄32～62岁，平均年龄（52．93±11．24）岁；男性70例，女性40例。

1．2 血浆HSP70抗体滴度的检测 采用蛋白质免疫印迹－酶联免疫吸附法（Western blot－ELISA），基本步骤如下：将细菌表达的重组人类HSP70抗原经10%十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳分离，电转移至硝酸纤维素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜；切下含 HSP70抗原的NC膜条并裁成2mm×2mm的膜片，分装入96孔酶标板，每孔加入200μL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗30min，吸去PBS后加入5%脱脂奶粉于37℃饱和封闭1h；按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释待检血浆，各加入200μL稀释液于酶标孔中，记录加样顺序。4℃孵育过夜，弃去稀释血浆，加入200μL Tris缓冲液（TBS）洗涤10min，重复6次。每孔加入200μL 1∶500稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人IgG，37℃孵育育2h。200μL TBS洗涤10min，重复8次。100μL DAB显色液显色5～10min，37℃温育可加快显色速度。

结果判断：终止显色，阳性结果为NC膜一面的中间有一条肉眼可见的棕色条带，另一面则没有或极弱。阴性则无棕色条带。

1．3 统计学处理 对两组患者的年龄进行非配对t检验，采用χ2检验分析性别构成比、HSP70抗体阳性率，采用非条件Logistic回归分析HSP70抗体与T2DM的关系。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 T2DM组与对照组HSP 70抗体的检测结果T2DM组与对照组HSP70抗体阳性例数分别为36例和9例，两组差异有统计学意义（P＜0．05），不同滴度HSP70抗体的阳性例数在两组之间差异均有统计学意义（P＜0．05）。见表1。

表1 两组HSP70抗体的检测结果n（%）

2．2 HSP70抗体与T2DM的关系 针对HSP70抗体与T2DM关系的非条件多元Logistic回归分析结果见表2。

表2 T2DM危险因素的非条件Logistic回归分析

3 讨 论

热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一组在进化上高度保守的蛋白质，按其分子量大小可分为 HSP90－100、HSP70、HSP60、小分子 HSP及泛素等几个家族。其中HSP 70家族因具有广泛的生物学功能而成为当今生命科学研究中的热点［1］。

HSP的“分子伴侣”功能己被人们所了解，它通过与多种具有不同功能的蛋白质在细胞中形成复合体而参与有关蛋白的折叠、亚基的组成、细胞内运输及蛋白质降解等过程，保护细胞免受损伤和其它应激的影响［2］。HSP70亦参与炎性反应与免疫应答。一旦机体由于化学和物理因素的刺激导致HSP的高表达，T细胞免疫和体液免疫就被激活，产生HSP70抗体，诱发针对机体的炎性反应和免疫反应［3］。目前许多研究［4］提示，HSP抗体与疾病的发生、治疗或预后有关。邬堂春等［5］发现，血浆中HSP70抗体的出现与多种疾病（如中暑、苯中毒、高血压、免疫性疾病等）有关。但是关于抗人HSP抗体在T2DM患者中是否存在，以及其与T2DM发病的关系，目前研究尚少见。

本研究结果显示，112例T2DM患者中抗HSP70抗体阳性36例，110例对照组中抗体阳性9例，两组抗体阳性率比较差异有统计学意义（P＜0．05）。Logistic回归分析显示，抗HSP70抗体是T2DM的独立危险因素。

本研究结果提示，HSP70抗体与T2DM发病相关，但是关于HSP70抗体如何影响T2DM发病原因尚不明确，有待进一步研究。

［1］ Weng D，Calderwood SK，Gong J．Preparation of a heat－shock protein 70－based vaccine from DC－tumor fusion cells ［J］．Methods Mol Biol，2011，787：255－265．

［2］ Gobbo J，Gaucher－Di－Stasio C，Weidmann S，et al．Quantification of HSP27and HSP70molecular chaperone activities［J］．Methods Mol Biol，2011，787：137－143．

［3］ Borges TJ，Wieten L，van Herwijnen MJ，et al．The anti－inflammatory mechanisms of Hsp70［J］．Front Immunol，2012，3：95．

［4］ Wu T，Chen S，Xiao C，et al．Presence of antibody against the inducible Hsp71in patients with acute heat－induced illness［J］．Cell Stress Chaperones，2001，6（2）：113－120．

［5］ 邬堂春，贺涵贞，张国高．热应激蛋白研究的进展与前景［J］．中华预防医学杂志，2000，34（1）：6－7．