锰超氧化物歧化酶模拟化合物诱导人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3凋亡的研究

李卫 何援利 米登海

（1．南方医科大学珠江医院妇产科，广东广州 510282；2．甘肃省第二人民医院肿瘤科，甘肃兰州 730000）

锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）主要存在于真核细胞、原核细胞及线粒体基质中，它作为一种重要的抗氧化剂在机体防御疾病的过程中起着重要作用。天然的MnSOD分子质量大、在体内半衰期短、稳定性差、易被蛋白水解，且长期应用可诱发免疫和过敏反应，这些不足限制了其临床应用［1］。文献［2－4］报道，人工合成的MnSOD即锰超氧化物歧化酶模拟化合物（mimics of manganese superoxide dismutase，MnSODm）对敏感和耐药的白血病细胞的活性具有较强抑制作用。我们的试验也表明，MnSODm对人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3的裸鼠移植瘤有治疗作用。本实验研究MnSODm对SKOV3细胞的凋亡效应，并探讨其可能的机制。

1 资料与方法

1．1 材料 MnSODm由兰州大学化工学院刘伟生教授提供，分子式为C40H57Mn2N9O21；SKOV3细胞株购自韩国细胞银行，RPMI1640培养基为美国GibcoBRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。活细胞计数试剂盒（cell counting kit－8，CCK－8）购自日本同仁化学研究所，生物洁净安全柜购自江苏苏净公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）单染试剂盒购自美国Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 SKOV3细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下进行培养，每2～3d换液1次，待细胞长满80%～90%进行传代。

1．2．2 细胞增殖能力和活性的测定 取对数生长期的SKOV3细胞，以0．25%胰酶消化，计数并接种于96孔培养板内，调整细胞浓度为3×103个／孔，加入 MnSODm（分为3个浓度梯度，即0、10、50μg／mL，0μg／mL为空白对照组）。分别培养0、24、48和72h后，按照CCK－8试剂盒说明书，在上述时间点，每孔加入10μL的CCK－8溶液，将培养板在培养箱内孵育2h，用酶标仪测定450nm处的吸光度，即A值。

1．2．3 PI单染检测凋亡细胞 加入不同浓度梯度的 MnSODm（0、10、50μg／mL）处理SKOV3细胞72h后，去除上清液，加入200μL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，离心并去除PBS，加入冰预冷的70%乙醇固定，4℃放置24h，离心弃去固定液，加入100μL核糖核酸酶（RNase）和PI染液，4℃避光30min，荧光显微镜下观察凋亡细胞变化。

1．2．4 细胞形态学观察 SKOV3细胞经不同浓度梯度（0、10、50μg／mL）MnSODm处理0、24、48、72h后，在倒置显微镜下观察活细胞数目和形态的改变。

1．2．5 caspase3／7 活性检测 将对数生长期的SKOV3细胞加于96孔培养板中，依据 MnSODm的不同浓度（0、10、50μg／mL）将其分为3组，分别培养72h，将caspase3／7底物和PBS混合后取100 μL加入以上各孔，37℃反应30min。用荧光分光光度计分析。

1．3 统计学处理 采用SPSS13．0软件处理数据，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间分析比较采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 MnSODm处理SKOV3后细胞的增殖能力和活性 MnSODm对SKOV3细胞增殖有明显抑制作用，对SKOV3细胞活性亦有明显抑制作用。见表1。

表1 不同浓度MnSODm对SKOV3细胞增殖能力和活性及caspase3／7活性的影响（±s，n）

表1 不同浓度MnSODm对SKOV3细胞增殖能力和活性及caspase3／7活性的影响（±s，n）

注：与同时间0μg／mL浓度组比较，＊P＜0．01

MnSODm（μg／mL） A值0h 24h 48h 72h 72h细胞活性率（%） 72hCaspase3／7活性（RFU）0 0．567±0．021 0．929±0．013 1．457±0．038 1．910±0．033 100．0±1．7 2 618±247 10 0．567±0．021 0．832±0．015＊ 1．100±0．039＊ 1．290±0．045＊ 67．5±2．4＊ 2 753±259 50 0．567±0．021 0．621±0．027＊ 0．558±0．044＊ 0．318±0．018＊ 16．6±0．9＊2 474±221

2．2 细胞凋亡形态学的变化 在荧光倒置显微镜下观察发现，空白对照组细胞生长状态良好，表现为细胞伸展、透亮且折光性好；而10、50μg／mL Mn－SODm处理后的细胞伸展度降低，部分细胞体积变小、皱缩，折光性差。见图1。

2．3 PI染色检测MnSODm对SKOV3细胞凋亡的影响 空白对照组细胞核呈圆形，边缘清晰，染色均匀；而10、50μg／mL MnSODm处理的细胞核边缘不规则，染色质凝集，着色较重，核固缩，核着色强阳性细胞数明显高于空白对照组。见图2。

图1 MnSODm作用SKOV3细胞72h后细胞大体观

2．4 不同浓度 MnSODm对caspase－3／7活性的影响 SKOV3细胞经10和50μg／mL MnSODm处理72h后，caspase－3／7的活性与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。见表1。

图2 PI染色后荧光显微镜下凋亡细胞的改变

3 讨 论

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于生物体内的含铜、锰、铁等金属离子的酶，它能够有效清除活性氧以及氧化过程中产生的超氧阴离子自由基（O2－·），是生物体抗氧化系统的第一道防线［5］。

MnSOD过量表达在多数肿瘤细胞中可抑制细胞生长，其机制尚不明确。目前认为，细胞氧化还原状态失衡引起细胞生长障碍，MnSOD过量表达使线粒体中的减少，如果分解H2O2的酶未相应增加，H2O2浓度将会增高，引起细胞代谢障碍和生长抑制。高浓度的H2O2和一氧化氮（NO）能够协同抑制肿瘤生长，原因在于NO在H2O2存在下生成羟自由基（·OH），增加了单链 DNA 损伤［6］。MnSOD过量表达时，谷胱甘肽过氧化物酶和H2O2酶代偿性增加，NO可能通过抑制H2O2酶的作用而减少H2O2的分解，维持 MnSOD过量表达，使H2O2处于高水平状态。MnSOD过量表达使细胞对谷胱甘肽（glutathion，GSH）合成阻滞剂—丁胱亚磺酰亚胺的敏感性增加，并使H2O2产生增加，使还原性与氧化性谷胱甘肽（GSSG）的比值即GSH／GSSG减少，这可能与NO敏感性亢进有关。

Bernard等［7］研究显示，MnSOD过量表达可清除肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导产生的而使细胞凋亡逃逸，但细胞内H2O2蓄积后则会抑制细胞的增生并促进其凋亡，当MnSOD转化的H2O2超过MnSOD清除的能力时，将会导致由细胞色素C及caspase－3、6、8、9启动的细胞凋亡。因此，MnSOD过量表达对肿瘤的保护或抑制作用受之间平衡的制约。MnSOD不仅可以通过调节平衡而抑制或促进细胞增殖，还可以通过调节信号转导相关蛋白促进或抑制细胞凋亡［8］。

本研究结果显示，MnSODm有促进SKOV3细胞凋亡的作用。MnSODm通过线粒体途径和死亡受体途径激发caspase家族活性，从而诱导敏感和耐药的白血病细胞凋亡［3］。caspase家族成员以无活性的酶原形式存在于细胞内，caspase的活化途径有线粒体途径、死亡受体途径和内质网通路。上述通路最终激活caspase－3、7、6、8、9，诱导细胞凋亡。但本实验结果表明，MnSODm处理后的SKOV3细胞中caspase－3／7的活性与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05），说明MnSODm并非通过激活caspase－3／7而诱导SKOV3细胞凋亡，其诱导SKOV3凋亡的机制尚待进一步研究。

［1］ Krämer R．The pharmaceutical potential of manganese－based superoxide dismntase mimics［J］．Angew Chem Int Engl，2000，39（24）：4469－4470．

［2］ 安娴，魏虎来，祁萍，等．MnSOD模拟化合物诱导人白血病多药耐药 K562／ADM 细胞凋亡［J］．现代肿瘤医学，2008，16（5）：703－706．

［3］ 范临兰，魏虎来，窦伟，等．MnSOD模拟化合物通过线粒体途径诱导K562／ADM细胞凋亡［J］．第四军医大学学报，2008，29（24）：2248－2251．

［4］ 范临兰，魏虎来，窦伟，等．锰超氧化物歧化酶模拟化合物诱导K562细胞凋亡的机制研究［J］．中国药理学通报，2009，25（10）：1363－1366．

［5］ Ho JC，Chan－Yeung M，Ho SP，et al．Disturbance of systemic antioxidant profile in nonsmall cell lung carcinoma［J］．Eur Respir J，2007，29（2）：273－278．

［6］ Kim KH，Rodriguez AM，Carrico PM，et al．Potential mechanisms for the inhibition of tumor cell growth by manganese superoxide dismutase［J］．Antioxid Redox Signal，2001，3（3）：361－373．

［7］ Bernard D，Monte D，Vandenbunder B，et al．The c－Rel transcription factor can induce and inhibit apoptosis in the same cells via the uqregulation of MnSOD［J］．Oncogene，2002，21（28）：4392－4402．

［8］ Zhang Y，Gu J，Zhao L，et al．Complete elimination of colorectal tumor xenograft by combinde manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand gene virotherapy［J］．Cancer Res，2006，66（8）：4291－4298．