肝癌肝动脉化疗栓塞治疗对缺氧诱导因子2α表达的影响及其临床意义

孙海香 杨欣荣 徐泱 樊嘉，2

（1．复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032；2．复旦大学附属生物医学研究院，上海 200032）

肝动脉化疗栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）是治疗中晚期肝癌常选的非手术治疗方法。缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor 2 alpha，HIF－2α）是细胞适应缺氧微环境的重要转录因子，是HIFs家族的重要成员之一。HIF－2α参与细胞代谢、增殖、凋亡和血管生成，在非小细胞肺癌、胰腺癌、宫颈癌和结直肠癌等多种肿瘤中表达异常［1－2］。目前，关于 HIF－2α在肝癌中的表达研究较少，且争议颇多［3－6］。本研究旨在探讨 TACE治疗对肝癌组织中HIF－2α表达水平的影响，并分析其表达水平与其他病理因素的相关性，企盼阐明HIF－2α在肝癌的发生、侵袭与转移中的作用机制。

1 资料与方法

1．1 一般资料 采用复旦大学附属中山医院2001—2005年经TACE治疗后手术切除的157例肝癌患者的肝癌组织，用于组织芯片染色。组织芯片的制备参考Gao等［7］的作法。从上述157例肝癌组织中随机选取30例肝癌组织；同时收集未经TACE治疗而直接行手术切除的30例肝癌患者的肝癌组织。

1．2 试剂 RIPA裂解液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；实时荧光定量逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）试剂盒（日本 Takara公司）；HIF－2α及3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程公司合成；HIF－2α及GAPDH抗体（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗免疫组化试剂盒（上海长岛生物技术公司）。

1．3 RT－PCR检测 HIF－2α基因表达 肝癌组织RNA抽提参照Trizol试剂盒说明书操作。HIF－2α和GAPDH的引物序列同参考文献［4］，按试剂盒说明书操作，反应条件为：94℃预变性5min后；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

1．4 蛋白质印迹法（Western blot）检测 HIF－2α蛋白表达 采用考马斯亮蓝法（Bradford法）检测标本组织抽提液中总蛋白的浓度，操作步骤参照说明书。

1．5 免疫组织化学（IHC）方法检测 HIF－2α蛋白分布 采用IHC－SP法，参照试剂盒说明书进行操作。按照阳性细胞数占同类计数细胞的百分比，将染色结果分为低表达与高表达，以50%为标准。

1．6 统计学处理 采用SPSS 12．0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 TACE治疗后肝癌组织中 HIF－2α的表达TACE治疗后肝癌组织中HIF－2α的mRNA水平显著上升（P＜0．05），见图1A；Western blot也显示，TACE治疗后HIF－2α蛋白表达水平显著上升，与非TACE治疗而直接手术治疗的肝癌患者的HIF－2α表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0．05），见图1B。

图1 TACE组和手术组术后肝癌组织中HIF－2α的mRNA及蛋白的表达水平

2．2 IHC分析TACE治疗后肝癌组织中 HIF－2α的表达分布 IHC显示，HIF－2α蛋白阳性信号主要定位于肝癌细胞的细胞核和胞浆中，呈棕黄色或者褐色，见图2。

图2 肝癌组织中HIF－2α表达情况（A～C：×100；D～F：×200）

2．3 HIF－2α在TACE治疗的肝癌患者中的临床意义 甲胎蛋白水平、γ－谷氨酰转肽酶水平、肿瘤直径和包膜完整性与肝癌患者的总体生存时间（overall survival，OS）相关（P＜0．05）；γ－谷氨酰转肽酶水平、肿瘤直径和包膜完整性与肝癌患者的无瘤生存时 间 （disease－free survival，DFS）相 关 （P＜0．05）；HIF－2α蛋白表达水平与肝癌患者的 OS相关（P＜0．05），而与DFS无关（P＞0．05）。

3 讨 论

TACE是中晚期肝癌常用的治疗方法。TACE既可直接在肿瘤组织中施以药物杀伤癌细胞，又可栓塞供养肿瘤的血管，阻断肿瘤血供，致肿瘤组织缺血、缺氧，进而使肿瘤失去活力。HIF－2α能调节肿瘤坏死因子－α、c－Myc、血管内皮生长因子、Twist等多个在肿瘤生长、转移和血管生成等过程中起着重要作用的基因的表达。目前，关于HIF－2α在肝癌中的研究相对较少，其作用也有争议。有研究［6］指出，HIF－2α表达水平与肝癌中的血管密度相关，HIF－2α水平高的患者预后较差。也有研究［4］表明，HIF－2α可促进肝癌细胞自噬、凋亡，提示HIF－2α可能在肝癌发生过程中起着抑制作用。也有研究［8］发现，HIF－2α参与E2F1信号通路，促进细胞凋亡，肝癌组织中HIF－2α的表达水平与肿瘤直径呈负相关。本研究发现，TACE治疗后肝癌组织中HIF－2α的表达水平显著上升，并且其表达水平与肝癌患者的OS相关，这进一步证实HIF－2α参与了肝癌的发展。进一步深入研究HIF－2α的功能及其作用机制，将对肝癌的治疗具有十分重要的意义。

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