自制肺炎衣原体抗原的临床应用

徐坚 胡志雄 杜红梅 孙书明 徐林根 余竹元

（1．复旦大学附属金山医院，上海 201508；2．复旦大学附属中山医院，上海 200032）

肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，Cpn）是一类能通过细菌滤器、有独特发育周期的专性细胞内寄生的原核细胞型微生物，是衣原体属中的新种。约10%的人类急慢性呼吸系统感染性疾病（如社区获得性肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎）由Cpn引起；Cpn还与中耳炎、虹膜炎、心肌炎、心内膜炎、脑膜炎、系统性红斑狼疮、结节性红斑等疾病有关；Cpn也是艾滋病、白血病患者继发感染的重要病原菌之一。Karimi等［1］报告，健康献血者血中也可检出Cpn－DNA和抗原，普通人群中Cpn的感染率更高。Lin等［2］报告，在中国台湾成年人中，血清Cpn－IgG阳性率达45．5%。国内外诊断Cpn感染的方法有病原体直接检出法、核酸检测法和血清学方法。最常用的血清学方法是微量免疫荧光（micro－immunofluorescence，MIF）法，被公认为是血清学诊断Cpn感染的金标准［3］。国内所用的Cpn抗原（Cpn－Ag）至今仍依赖于进口。近年来，我们自制Cpn－Ag并将其用于临床检测，发现与进口Cpn－Ag具有相似的效果，现报告如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择2005年11月—2011年9月在复旦大学附属金山医院就诊的268例患者，其中冠心病、高血压、心肌梗死等心血管疾病患者61例；肺炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘、肺癌等呼吸系统疾病患者132例；慢性鼻炎、鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎等耳鼻咽喉疾病患者75例。

1．2 实验方法

1．2．1 Cpn的分离、培养和传代

1．2．1．1 人外周血单核细胞（PBMC）的分离和PBMC中Cpn－Ag的检测：依据参考文献［4］。抗原阳性判断标准 ：≥100个亮点为强阳性，10～100个亮点为阳性，5～10个亮点为弱阳性，≤4个亮点为阴性。

1．2．1．2 Cpn的分离、培养和2次传代：配制无血清的1640培养液、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）液，并用NaHCO3调pH值至8．0，备用。将Cpn阳性的PBMC制成0．2mL PBMC悬液，边振荡边在90s内滴入0．2mL 30%的PEG，使Cpn从PBMC中释放出来，然后移入铺满Hep－2细胞的含有1．8mL 1640培养液的培养瓶中，混匀后离心1 h，然后加入11mL Cpn生长介质［含4%胎牛血清、庆大霉素（25μg／mL）、万古霉素（25μg／mL）、两性霉素B（2．5μg／mL）、放线菌酮（0．5μg／mL）和葡萄糖（4．5mg／mL）］，置于 CO2培养箱中37．4℃培养。第3天离心并更换Cpn生长介质；第4天、第5天再分别离心1次；培养7d。将Cpn－Ag阳性的第1次传代的Hep－2细胞冻融破碎2次后，分成2份倒入另2瓶铺满Hep－2细胞的培养瓶中，离心1h后放入培养箱继续培养。在转染后的第3、4、5天分别离心1h，继续培养；2d后取部分Hep－2细胞检测Cpn－Ag。采用PCR法检测2代Hep－2细胞中Cpn－DNA。

1．2．2 自制Cpn－Ag与进口Cpn单克隆抗体（Cpn－McAb）结合反应的评估

1．2．2．1 Cpn－Ag的制备：将2次传代 Cpn－Ag阳性的Hep－2细胞（106／mL）冻融破碎，制成混悬液，作为本实验自制的Cpn－Ag。

1．2．2．2 自制Cpn－Ag与Cpn－McAb的结合反应：采用Dot－ELISA法，硝酸纤维素膜上呈现棕褐色斑点为阳性，不显色为阴性。

1．2．3 应用自制 Cpn－Ag与进口 Cpn－Ag（AR39－Ag）同时检测临床血浆样本：采用MIF法检测血浆抗Cpn特异性抗体（IgA、IgG和IgM）。Cpn感染的MIF诊断标准如下，IgA、IgM抗体阳性：滴度≥1∶16；IgG抗体阳性：滴度≥1∶64［5］。

1．3 统计学处理 采用SPSS 13．0软件进行统计学分析。对同一样本的每一检品分别用自制及进口Cpn－Ag进行检测，计数检测结果同时为阳性、同时为阴性及分别阳性的标本个数；然后进行一致性检测，Kappa值＞0．75为具有高度一致性。对两抗原检测阳性结果的抗体滴度水平进行统计，取其几何均数，并进行t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 分离、培养Cpn后MIF的检测结果 Cpn－Ag阴性的Hep－2细胞，特征性苹果绿亮点≤4个亮点／视野；Cpn－Ag阳性的 Hep－2破碎细胞（2次传代培养7d后的Hep－2破碎细胞）可见特征性苹果绿亮点≥100个／视野。

2．2 2次传代的Cpn的PCR检测结果 扩增产物在1．2%琼脂糖凝胶中电泳，可见含有Cpn－DNA特异序列的437bp的片段。

2．3 Dot－ELISA 法 观 察 自 制 的 Cpn－Ag 与 进 口Cpn－McAb的结合反应 结果显示，自制的Cpn－Ag能够与进口Cpn－McAb发生抗原抗体反应。

2．4 检测血浆中Cpn抗体滴度 自制的Cpn－Ag与进口Cpn－Ag的检测一致率均达90%以上；以进口Cpn－Ag检测为标准，自制Cpn－Ag检测灵敏度、特异度均在90%以上；阳性似然比＞10，其中IgM阳性似然比高达30；阴性似然比＜0．1，见表1～3。配对卡方检验显示，自制与进口Cpn－Ag检测血浆IgA、IgG、IgM结果比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；一致性检验Kappa值＞0．75，两者具有高度一致性，见表4～6。

表1 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测血浆Cpn－IgA的一致性分析

表2 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测血浆Cpn－IgG的一致性分析

表3 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测血浆Cpn－IgM的一致性分析

表4 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测268例血浆Cpn－IgA结果分析

表5 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测268例血浆Cpn－IgG结果分析

表6 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测268例血浆Cpn－IgM结果分析

2．5 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测阳性结果的抗体滴度的分析 取几何均数，显示自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测3种抗体滴度的均数差异均＜1个稀释度，两种抗原检测阳性结果的抗体滴度总体水平的差异无统计学意义（P＞0．05），见表7。

表7 自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测阳性结果抗体滴度几何均数比较

3 讨 论

Cpn与多种疾病的发病相关，由于Cpn感染缺乏特异性，因此其诊断主要依靠实验室检查［6］。目前，MIF法被认为是血清学诊断急慢性Cpn感染的金标准。

我们自制了Cpn－Ag，并评估其对血浆样本的检测效果。Dot－ELISA结果表明，自制的Cpn－Ag可与进口的Cpn－McAb发生抗原抗体反应。随后我们采用自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag，通过 MIF法检测了患者的血浆样本。表1～3结果显示，自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测同时阳性者IgA（＋）141例，符合率92．5%；IgG（＋）153例，符合率92．2%；IgM（＋）91例，符合率95．1%。进行配对卡方检验，按α＝0．05水准，自制Cpn－Ag与进口Cpn－Ag检测血浆中3种Cpn抗体的差异无统计学意义（P＞0．05）。进一步进行一致性检测，Kappa值均＞0．75，表明两种抗原的检测结果具有高度的一致性。以进口Cpn－Ag检测为金标准，自制的Cpn－Ag检测血浆样本中的Cpn－IgA的灵敏度和特异度分别为94．0%、90．7%，IgG 分别为92．7%、91．3%，IgM 分别为91．9%、97．0%。故本研究中自制Cpn－Ag可用于Cpn感染的的诊断。同时，为全面评估此诊断试验的诊断价值，我们计算了似然比，IgA和IgG阳性似然比约为10，即阳性结果中来自Cpn感染的可能性为非Cpn感染的10倍；阳性似然比在IgM高达30；而针对3种抗体的阴性似然比均＜0．1，即阴性结果中来自Cpn感染的可能性为非Cpn感染的1／10以下。以上结果均表明，自制Cpn－Ag对血浆样本中Cpn的诊断效果较理想。对于两种抗原检测的阳性结果，对其抗体滴度水平进行统计，取其几何均数，显示两种抗原检测3种抗体滴度的几何均数相近，差异均＜1个稀释度；进行两独立样本t检验，两种抗原检测阳性结果的抗体滴度总体水平的差异无统计学意义（P＞0．05），见表7。

综上所述，本研究中自制的Cpn－Ag用于检测患者血浆中Cpn－IgA、IgG、IgM，有较高的灵敏度和特异度，与进口Cpn－Ag检测具有高度一致性。自制Cpn－Ag的方法简便、价格低廉，通过5年多来的临床标本检测应用，其结果可靠。

［1］ Karimi G，Samiei Sh，Hatami H，et al．Detection of Chlamydia pneumoniae in peripheral blood mononuclear cells of healthy blood donors in Tehran Regional Educational Blood Transfusion Centre［J］．Transfus Med，2010，20（4）：237－243．

［2］ Lin CY，Su SB，Chang CC，et al．The association between Chlamydia pneumoniae and metabolic syndrome in Taiwanese adults［J］．South Med J，2009，102（12）：1203－1208．

［3］ Bennedsen M，Berthelsen L，Lind I，et al．Performance of three microimmunofluorescence assays for detection of Chlamydia pneumoniae immunoglobulin M，G，and A antibodies［J］．Clin Diagn Lab Immunol，2002，9（4）：833－839．

［4］ 王卫群，张瑞华，龚辉，等．外周血单核细胞中肺炎衣原体特异性抗原的检测［J］．中国临床医学，2002，9（3）：243－245．

［5］ Brandén E，Koyi H，Gnarpe J，et al．Chronic Chlamydia pneumoniae infection is a risk factor for the development of COPD［J］．Respir Med，2005，99（1）：20－26．

［6］ 罗海波，张福森，何哲生，等．现代医学细菌学［M］．北京：人民卫生出版社，1995：214－216．