虹彩病毒胁迫下东北林蛙NF－κB和I－κB的差异表达1)

周 旋 肖向红 张晶钰 柴龙会 牛曙东 吕 晨

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

东北林蛙(Rana dybowskii)，属脊索动物门，两栖纲，无尾目，蛙科。东北林蛙的养殖是我国经济动物养殖业之一，具有很高的经济价值。近年来，东北林蛙种群数量逐年下降。研究显示，蛙病毒属的虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)是最重要的影响因素之一［1］。该病毒广泛的宿主范围、全球分布性以及高致病力，使得它们成为两栖类全球性的威胁。NF－κB是参与机体先天免疫的一类重要模式识别分子，也是连接先天免疫和获得性免疫的桥梁。研究证实，NF－κB信号通路是促炎症基因表达的枢纽之一，可诱导细胞因子、趋化因子、粘附因子、基质金属蛋白酶(MMP)、环加氧酶2(cox2)和诱导性一氧化氮合酶(iNos)的表达［2］。但目前对NF－κB信号通路的研究多集中在哺乳动物，两栖动物的NF－κB相关研究尚未见报道。本实验以东北林蛙为研究对象，利用荧光定量PCR技术，观察东北林蛙在受到RGV胁迫后，其体内NF－κB和I－κB分子的时空表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物及毒株:东北林蛙，40只，健康、雄性，2～3龄，体质量(20±2)g，2012年5月购自黑龙江省帽儿山林场;蛙虹彩病毒RGV9506，由中国科学院武汉水生生物研究所张奇亚教授馈赠，本实验室传代培养并保存。

主要试剂:Trizol Reagent，由美国 Invitrogen公司购买;琼脂糖，由Biowest公司购买;GelRed核酸凝胶染料，由美国Biotium公司购买;2×Taq Master Mix、DNA Marker 2000、50 bp DNA Ladder，由天根生化科技有限公司购买;Prime ScriptⓇ RT reagent Kit、Real Master Mix(SYBR Ⓡ Green Ⅱ)，由 Takara公司购买;小量胶回收试剂盒，由上海华舜生物有限公司购买。

1.2 总RNA提取和检测

东北林蛙经腹腔注射RGV 1 mL［3］(PBS稀释为106/mL)胁迫刺激。分别于 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、24.0、48.0、72.0 h 后取背部皮肤、肝脏、脾脏，－80℃保存，以0 h为空白对照组。用Trizol法提取总RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计检测其吸光度。

1.3 RT-PCR扩增和电泳检测

使用Primer premier 5.0软件，根据实验室高通量测序结果设计 β－actin、NF－κB1、NF－κB2和 I－κBα mRNA的上下游引物，引物由哈尔滨博仕生物公司合成。引物序列见表1。

表1 β－actin、NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 引物

取500 ng总RNA按照PrimeScriptⓇRT reagent Kit说明书进行反转录反应，以反转录产物为模板进行PCR反应(以β－actin为阳性对照)。PCR反应体系根据2×TaqMasterMix说明书配制，反应条件:94℃预变性3 min(94℃变性30 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、β －actin 54.5 ℃、I－ κBα 58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min)，30个循环，72℃延伸5 min。产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.4 制作标准曲线

切胶回收目的基因PCR产物，通过紫外分光光度计测定回收产物吸光度及浓度，产物质量浓度测定后，按下列公式计算各产物单位体积(单位:μL)的拷贝数(N)［4］:N=NA× C/MW。式中:NA为阿伏加德罗常数;C为产物质量浓度(单位:g/μL);MW为产物平均摩尔质量(单位:g/mol，MW=片段长度bp×660/bp)。

用已测质量浓度的切胶回收产物为母液制备质量浓度梯度样品，在25 μL反应体系中分别加入1 μL各稀释质量浓度的样品制作标准曲线。荧光定量PCR反应体系按照Real Master Mix(SYBRⓇGreenⅡ)说明书配制，荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s(95℃变性5 s，NF－κB1 56℃、NF－κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72℃读板)，40个循环，95℃延伸15 s。在72～95℃区间，以0.5℃为递增梯度进行溶解曲线分析。采用默认设置，自动生成C(t)值，每个样品重复3次。

1.5 实时荧光定量PCR

荧光定量PCR反应体系按照Real Master Mix(SYBRⓇGreenⅡ)说明书配制，荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s(95℃变性5 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火 30 s，72℃延伸30 s，72℃读板)，40个循环，95℃延伸15 s。在72～95℃区间，以0.5℃为递增梯度进行溶解曲线分析。每个基因的cDNA样本重复3次。

1.6 数据分析

用Opticon Monitor 3软件分析定量结果，取C(t)值的均数根据标准曲线计算各样品拷贝数。同一部位不同样本之间表达量差异显著性检验采用SPSS(18.0)的独立样本的T－test法。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取结果

利用紫外分光光度计检测提取的各样品组织总RNA的OD值，各样本OD260/OD280全部在1.9～2.1之间，经1%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的18S、28S RNA条带清晰(见图1)，说明样本无RNA降解、蛋白质污染，总RNA质量符合后续实验要求。

图1 东北林蛙组织总RNA电泳图

2.2 RT-PCR扩增结果

取500 ng总RNA经RT－PCR，得到目的条带清晰(见图2)，无特异扩增及引物二聚体，测序结果与引物设计时片段大小相吻合，且无杂带，表明反转录产物和特异性引物均满足后续Real－timePCR实验要求。测序结果与实验室高通量测序结果一致。

2.3 标准曲线

选用初始模板拷贝数适宜的目的基因标准品为母液制备质量浓度梯度样品(NF－κB2为9.7×(10－1～103)拷贝数/μL;NF －κB1为1.55×(101～105)拷贝数/μL;I－κBα为1×(101～105)拷贝数/μL)。对每个质量浓度的样品，设定3个重复。图3展示的是各标准品扩增产物起始模板质量浓度的对数值与对应C(t)值的关系图，NF－κB2、NF－κB1、I－κBα的标准方程的回归系数均在0.97以上，表现出良好的线性关系。

图2 目的基因RT－PCR产物电泳图

图3 目的基因标准曲线

2.4 NF － κB1、NF －κB2和I－κBα 定量结果

采用实时荧光定量PCR方法检测RGV胁迫下，NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 在东北林蛙肝脏、脾脏、皮肤中10个时间点的时空表达情况。目的基因溶解曲线为一个明显的峰(见图4)，表明在扩增中引物特异性较好，产物单一。C(t)值经标准方程计算出东北林蛙肝脏、脾脏、皮肤不同胁迫时间下的样品初始拷贝数(见图5)，在RGV刺激初期，与对照组相比形成NF－κB1和NF－κB2表达量立即大幅下调。从刺激后0.5 h，2个亚基在3个组织中都有上调趋势，分别在刺激后2 h(肝脏)和4 h(皮肤)快速上调至峰值，NF－κB1和NF－κB2在肝脏中为760 bp和1082 bp、在皮肤中为551 bp和1 921 bp;在脾脏中2亚基上调趋势缓慢，分别在16 h(NF－κB2)和24 h(NF －κB1)达到峰值，NF－κB1和NF－κB2分别为758 bp和659 bp。2亚基表达至峰值后开始下调，并在8 h(在肝脏中)和12 h(在皮肤中)下调至初始水平，在脾脏中2亚基72 h才达到初始水平。I－κBα在受刺激初期表达量也立即下调而后上调，并且其上调时间与NF－κB的上调时间点基本相同。统计学分析表明，定量结果有统计学意义(P＜0.05)。

图4 目的基因溶解曲线图

3 讨论

随着全球环境的变化，生物多样性不断受到破坏，作为衡量生态环境优劣的指示动物——两栖动物数量正逐年减少。引起两栖动物种群衰退的原因主要包括新引入的捕食者［5］、紫外线辐射的增加［6］、生境的破坏和退化、化学污染以及由病原微生物引起的感染性疾病的流行［7］等，其中感染性疾病流行与某些两栖类种群的区域性灭绝有重要的关联［8］。已有研究表明，蛙病毒属RGV也是两栖动物重要的病原之一［1］。RGV主要感染两栖类、爬行类和硬骨鱼类［9］。Brunner等［10］研究显示，实验室和野生条件下蝾螈(salamandrae)可作为病毒携带者而不发病，并在接触RGV后能诱导机体产生适应性免疫应答。

蛙类皮肤光滑潮湿并且无角质层保护，其皮肤能够分泌具有抗微生物活性的物质，作为抵御病原微生物入侵的第一道屏障;肝血窦的枯否氏细胞具有吞噬作用;脾脏作为最活跃的免疫器官是血源性抗原产生应答的主要场所。谢简等［11］通过RGV人工感染美国青蛙(Rana grylio Stejneger)幼蛙经免疫组化法检测显示，病毒感染呈现的阳性反应可深达肝脾脏的实质层，推测肝脾组织可能是RGV感染的主要靶器官。基于此，本实验以东北林蛙皮肤、肝脏和脾脏为靶器官，检测RGV胁迫后各器官中NF－κB的表达变化。

图5 NF－кB及I－кBα mRNA表达变化趋势

核转录因子κB(NF－κB)能与多种细胞基因启动子或增强子序列特定位点发生特异性结合而促进转录和表达，在炎症反应、免疫应答等疾病的发生、发展过程中起重要作用。NF－κB位于Toll样受体(TLR)下游信号通路的枢纽位置，当细胞受到病原体刺激后产生应激反应，使NF－κB与I－κB解离，从而进入细胞核，与相应的靶序列结合，调节基因转录表达，启动针对病原微生物的固有免疫和获得性免疫。在果蝇中，NF－κB/Rel同源蛋白 Dorsal和Dif由Toll受体激活，分别在幼体和成体抗真菌和革兰氏阳性菌的免疫应答中起转录激活作用［12］。王冬冬［13］研究显示，中国明对虾在受白斑综合症病毒(WSSV)刺激后Relish(哺乳动物NF－κB1和NF－κB2的同源蛋白)基因表达呈现先下调，而后上调，再下调，最后恢复正常水平的变化趋势，并且可调控下游多种效应因子对WSSV进行免疫防御。

两栖动物是低等水生动物过渡到真正陆生动物的中间类型，在脊椎动物进化史上有着重要地位。本实验通过荧光定量PCR检测东北林蛙NF－κB的表达变化，结果显示，在不同组织中NF－κB1和NF－κB2两个亚基的表达水平有差异，NF－κB2表达量约是NF－κB1的2倍，且皮肤和脾脏中的表达量明显高于肝脏。在RGV刺激下，与对照组相比，NF－κB1和NF－κB2表达量立即大幅下调;肝脏和皮肤中，在刺激后2 h(在肝脏中)和4 h(在皮肤中)上调至峰值;在脾脏中，2亚基上调趋势缓慢，分别在16 h(NF－κB2)和24 h(NF－κB1)达到峰值;2亚基表达至峰值后开始下调，并在8 h(在肝脏中)和12 h(在皮肤中)下调至初始水平，在脾脏中2亚72 h才达到初始水平。即:其表达变化呈现先下调，而后上调，再下调，最后恢复正常水平的趋势，与WSSV刺激下对明虾Relish基因的表达趋势相同［13］。说明在受刺激初期，主要由皮肤和肝脏起到对RGV的抵制作用，但是在刺激后期则主要有脾脏起免疫调控作用。I－κBα在受刺激初期表达量也立即下调而后上调，其上调时间点与NF－κB的上调时间点基本相同。结果表明，NF－κB被激活后，I－κBα也立即上调表达，且与NF－κB结合，使其失去活性。NF－κB/I－κB信号通路与RGV的关系可能极其复杂和紧密，RGV可利用NF－κB1和NF－κB2基因来增强其自身基因的表达，达到自身复制繁殖的目的。东北林蛙也需要依靠NF－κB1和NF－κB2基因调控下游多种免疫相关因子来防御RGV。

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