硝普钠(SNP)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的白桦Ty1－copia类逆转座子的克隆及分析1)

梁楠松 曾凡锁 李 博 郭 梁 詹亚光

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

逆转座子(retrotransposons)广泛分布在植物中，其种类繁多，是植物核基因组中重要的组成部分，它的增殖和转座主要以RNA为中间产物(DNA→RNA→DNA)，反转录成 DNA，在插入到基因组中［1］，逆转座子在植物基因组中有很高的拷贝性，对其序列的克隆与分析，以及对研究植物基因组组成、进化、系统发育、生物多样性以及表达调控都具有重要的意义。逆转座子包括长末端重复(long terminal repeat，LTR)和非长末端重复(non－LTR)两类，LTR 又可分为 Ty1－copia类和 Ty3－gypsy类［2］，其中 Ty1－copia类逆转座子是目前所知道的数目最多、研究最深入的LTR类逆转座子［3－4］。在植物逆转座子中，多数的逆转座子都是没有活性的，而它们的活性受环境和发育过程的调节。生物逆境胁迫和诱导能够激活特定的逆转座子转录［5－7］，例如用MeJA处理烟草叶片能够诱导逆转座子中Tnt1A的转录活性，2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)或水杨酸处理会使Tnt1C诱导表达［8］，2，4－D 还能够诱导苹果愈伤组织中 Ty1－copia 类逆转座子的转录活性［9］。Kimur Y 等［10］人研究发现伤害、紫外诱导、MeJA和水杨酸等诱导能使OARE－1逆转座子剧烈表达，说明OARE－1对非生物和生物胁迫都具有响应。在植物、动物和微生物中都能检测到同一类的逆转座子，并且这些逆转座子具有较高的相似性，说明逆转座子不仅可以在世代中进行纵向传递，而且还可以在物种间进行横向传递，逆转座子在纵向和横向传递过程中产生了高度异质性，而它的水平传递成为了不同物种间联系的桥梁。

白桦(Betula platyphylla Suk.)又称桦木，是桦木科(Betulaceae)桦木属(Betula Linn.)的一种。白桦是落叶乔木，树皮白色、其扎根深，耐贫瘠，耐严寒，喜酸性土壤，适应性强生长快，材质优良，是重要的工业树种。白桦树皮中含有的丰富的次生代谢产物具有医疗保健美容等重要功能，具有重大的开发价值。前人对诱导条件下提高白桦次生代谢产物的研究有很多报道但是对诱导胁迫下白桦逆转座子克隆以及Tyl－copia类逆转座子的转录活性的研究还未见报道。本试验从白桦愈伤组织中分离克隆了Tyl－copia类逆转座子部分逆转录酶序列，研究了诱导处理对Tyl－copia类逆转座子转录活性的响应以及特性，为今后进一步研究逆转座子对白桦次生代谢产物积累的响应等研究奠定基础。

1 材料与方法

白桦(Betula platyphylla Suk.)材料取自东北林业大学白桦强化种子园，并通过诱导白桦茎段获取愈伤组织。

材料处理:愈伤组织分别经2 mmol·L－1SNP和1 mmol·L－1MeJA 处理 12 h。

1.1 RNA的提取以及逆转录酶的扩增

RNA提取采用缓冲液冰浴CTAB法［11］，利用核酸蛋白分析仪，对提取的总RNA含量和质量进行检测。

RT－PCR:反转录用Oligo(dT)作下游引物合成cDNA第一条链，按照TaKaRa RNA PCR Kit操作指南进行。

引物:利用CODEHOP方法设计简并引物，以RTpl和RTp2为引物扩增Tyl组逆转录转座子RT基因片段。RTp1序列为 5’－CAGATGGACGTGAAGamngcnttyyt－3’，RTp2 序列为 5’－GATCATCATGtmrtcnryrta－3’，其中 m 代表 A 或 C，n代表 A或T或C或G，y代表C或T，r代表A或G。

反应体系:20 μL反应体系中10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol·L－1的 dNTP 2 μL，上下游引物各 20 pmol，rTaq 0.2 μL，cDNA/DNA 模板 2 μL，DEPC 水补足 20 μL。

扩增:为了优化反应条件分别采用了两种方法。①梯度 PCR，温度梯度为 40、44.1、47.2、50.4、53 ℃。PCR程序为:94℃ 3 min;94℃ 30 s，退火45 s，72℃45 s，30个循环;72℃ 7 min;4℃ 10 min。②采用两次降落PCR，将第一次扩增产物稀释100倍后经过同样的程序再次扩增富集PCR产物。程序为:94℃3 min;94℃ 30 s，53℃－0.8℃×n(n 为循环次数)45 s，72 ℃ 45 s，10 个循环;94 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s，72 ℃45 s，20个循环;72℃ 7 min;4℃ 10 min。

1.2 PCR产物的回收、克隆及纯化

PCR产物采用上海生工生物工程技术服务有限公司生产的UNIQ－10柱式DNA胶回收试剂盒回收，连接宝生物工程(大连)有限公司生产的pMD18－T Vector，并转化到大肠杆菌感受态细胞，37℃培养12～16 h，蓝白斑筛选挑取白色克隆浸到含100 mg·mL－1AmplB液体培养基中，37℃摇6～10 h后PCR检测。

1.3 逆转录酶序列测定及序列分析

采用双脱氧核苷酸链终止法，委托上海生工生物技术有限公司进行序列测定。获得的序列用blastx、blastn在 GenBank中进行检索分析，利用DNAMAN进行多序列比对，并利用MEGA 5.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果、重组质粒的鉴定及测序

试验初始参照Kumar等人［12］的研究结果，设计引物进行PCR扩增发现扩增结果不理想，后来利用CODEHOP(Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)来设计简并引物扩增的结果较好，并且通过梯度PCR产物的电泳结果来看(如图1)，不同退火温度对逆转录酶序列的扩增影响不大。但是在RT－PCR时，由于cDNA浓度太低，无法扩增出合适的条带，故采取降落PCR，提高序列配对的准确性，同时采用二次扩增，将一次扩增产物稀释100倍后作为模板进行二次扩增，来富集目的片段这样的扩增效果可以较好可满足后续实验。

图1 不同退火温度对逆转录酶扩增的影响

2.2 未处理下Ty1-copia类逆转座子的转录活性

在该实验中，我们以未处理的白桦愈伤组织的RNA为模版，通过RT－PCR扩增获得了一条大小为290 bp的序列，通过blastn和blastx证实其为Ty1－copia类逆转座子的逆转录酶基因的片段，blastx与Alstroemeria inodora的同源性为74%，命名为Bprt1。该序列包含下游YVDDML保守基序，但是上游的保守基序为TAFFHG，而非TAFLHG，有一个氨基酸的突变，即亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，均为疏水氨基酸，属于保守替换。从核酸的角度则是从CTT突变为TTT。另外，Bprt1存在一个终止密码子。

应用DNAMAN软件对Bprt1的氨基酸序列比对(如图2)，参与比对的序列有拟南芥逆转录转座子 AAF02855、黑杨 CAC95126、果蝇 P04146、柑橘CAJ09951、番 茄 AAK29467、烟 草 P10978、烟 草BAA11674和玉米AAA57005等8种生物中逆转座子的逆转录酶片段，其一致性为63.89%，Bprt1跟它们的同源性分别为 47.37%、41.49%、37.23%、52.63%、57.89%、61.05%、58.95%、38.95%。应用软件DNAMAN对Bprt1和8种生物的逆转座子逆转录酶的氨基酸构建系统进化树(如图3)发现虽然白桦与黑杨的亲缘关系最近，但是其对应的RT基因的亲缘性并非最近。

图2 Bprt1与另外8种生物中Ty1－copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列比对

图3 白桦Bprt1与其他生物Ty1－copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸系统进化树

2.3 SNP和MeJA处理后Ty1－copia类逆转座子的转录活性

在该实验中，随机挑取以2 mmol·L－1SNP进行处理12 h的白桦愈伤组织cDNA获得的11个白色单克隆进行测序，获得11条核酸序列，除一条为205 bp外，其他10条均在270 bp左右，经blastn和blastx比对后确定为Ty1－copia类逆转座子逆转录酶基因，命名为Bprt2～Bprt12，核酸序列比对后一致性为 78.79%，如图 4，异质性为 1.1%～43.1%。随机挑取以1 mmol·L－1MeJA处理12 h的愈伤组织cDNA为模版获得的10个白色单克隆，得到的10条核酸序列中有两条是完全一样的，认为得到9条核酸序列，其大小均在270 bp左右，符合预期，经blastn和blasrx比对后确定为Ty1－copia类逆转座子逆转录酶基因，命名为Bprt13～Bprt21，核酸序列比对后一致性为83.41%，如图5，其异质性为 1.1%～50%。如图6，比对获得的21条核酸序列，其一致性为 71.93%，异质性为 1.1% ～50.9%，翻译成氨基酸的异质性为0～57.1%，说明逆转座子具有高度的异质性。

如图7，应用DNAMAN对获得的21条转基因白桦中Ty1－copia类逆转座子逆转录酶片段构建进化树，发现经过SNP诱导的逆转录酶序列Bprt3、Bprt4、Bprt10、Bprt6、Bprt8 聚在一起，Bprt9和Bprt11聚在一起，Bprt7和 Bprt12聚在一起;而经MeJA诱导的逆转录酶序列Bprt13、Bprt17和Bprt18聚在一起、Bprt15和Bprt20聚在一起。说明逆转录转座子能够响应不同的信号而被激活，并且不同的诱导处理基本会使逆转座子各自聚类。

2.4 白桦和苹果Ty1－copia类逆转座子逆转录酶序列的比对分析

转座子的水平传递成为了不同物种间联系的桥梁，在植物、动物和微生物中都能检测到同一类的逆转座子，并且具有较高的相似性。高等植物同类型的逆转座子在纵向和横向传递过程中产生高度异质性［13］，这种异质性有时种内差异大于种属间［14］。本实验以白桦及苹果为例分析了逆转座子纵向传递的异质性和一致性。

图4 SNP诱导下白桦中Bprt2～Bprt12核酸序列比对

图5 MeJA诱导下白桦中Bprt13～Bprt21核酸序列比对

图6 白桦中Bprt1～Bprt21核酸序列比对

图7 白桦Bprt1～Bprt21逆转录酶的氨基酸系统进化树

我们从GENEBANK中下载了苹果(Malus×domestica Borka.)中的19条 Ty1－copia类逆转座子逆转录酶序列，序列号为DQ410748～DQ410766，其异质性为21.3%～52.3%，将本实验得到的21条序列与这19条的核酸序列比对，一致性为61.30%(如图8)，种间异质性为 28.2%～52.5%。进化树分析，如图9，白桦和苹果中Ty1－copia类逆转座子基本各自聚类，但是 Bprt9、Bprt11和 DQ410750进化关系比较接近聚为一类，Bprt15、Bprt19、DQ410751 和DQ410753的进化关系也比较接近。说明了逆转录转座子种内变异较大，而且种间变异也较大，但是种内变异可能大于种间。证明了逆转座子不仅存在垂直传递，也存在水平传递。

图8 白桦Bprt1－Bprt21和苹果DQ410748～DQ410766的核酸序列比对

图9 白桦Bprt1～Bprt21和苹果DQ410748～DQ410766逆转录酶的氨基酸系统进化树

3 结论与讨论

简并度是简并引物的种类数，是该简并引物内所有简并碱基的简并个数之积。本研究中采用CODEHOP设计简并引物，所用的上游引物的简并度为128、下游引物的简并度也为128，简并度较大，退火温度为45℃，比较低，退火温度的不适宜即过高会使PCR效率过低，过低则会使非特异扩增过多均会对后面克隆测序的结果产生影响。而且RT－PCR第一步获得的cDNA的浓度也较低，因此在实验中结合梯度PCR和降落PCR提高准确性，采用二次PCR使PCR产物富集提高浓度，达到的效果比较好。并且前后两次采用同样的引物序列对实验结果没有影响。

詹亚光等［15］于2001年开始通过农杆菌介导法首次将bgt基因成功转入白桦中，并获得抗性植株，而基因沉默首先也是在转基因植物中发现的，而转基因植物是否成功不仅仅是在转基因植株中检测到外源基因，更重要的是外源基因能够在植株中稳定表达。而转基因植株中常常会出现外源基因沉默的现象。而甲基化导致外源基因沉默也是一个抑制逆转座子活性的重要调节机制，而转座活性经常与甲基化不足联系在一起［16］，例如对去甲基化突变的研究表明转座子和/或逆转座子能够在转录甚至在转座水平上被激活，因而有力的证明胞嘧啶甲基化和转座子的表达调控有密切的联系［17］，并且逆转座子的重复或插入也可诱导外源基因的基因沉默。随着植物基因工程研究的深入，人们开始关注外源基因在转化体及其子代中的整合稳定性和表达有效性，从外源基因的整合特性、甲基化、外界因素等表观遗传的角度研究其表达状况。本文选取白桦为实验材料进行研究，也是为后续对转基因白桦中逆转座子DNA序列中胞嘧啶甲基化的频率、重复序列的插入或者缺失以及逆转座子的活性与外源基因的表达关系的研究奠定基础为转基因植株外源基因表达稳定性提供参考依据。

在通常情况下，逆转座子在植物中是没有转录活性的，而只有受到生物或非生物胁迫后才可以被转录激活。SNP处理白桦悬浮细胞可以有效提高异黄酮等次生代谢产物的积累，而茉莉酸甲酯处理可以提高三萜类物质、齐墩果酸和白桦脂醇等次生代谢产物的含量［18］，而异黄酮、三萜类物质、齐墩果酸和白桦脂醇都具有很高的药用价值。本文采用SNP和MeJA诱导处理，分别克隆回收到了11条和9条有转录活性的逆转座子，通过分析发现应用不同的胁迫诱导处理会聚集不同逆转座子，初步证明不同的Tyl－copia类逆转座子能够分别响应不同的信号而被转录激活。有研究表明，逆转座子有捕捉植株内源基因的诱导型启动子的能力［19］，从而提高某些基因的表达。然而，白桦次生代谢产物的积累与逆转座子之间的作用机理，还有待进我们一步的研究。

同一植物内逆转座子保守性较强如Bprt6和Bprt10的一致性高达98%。但同一植物内的同一类型逆转座子序列变异也较大，如Bprt1和Bprt15的一致性为50%;而不同物种间逆转座子却也可能有很高的相似性，这在其他物种上也得到了验证［20－21］。Asins等［22］人研究发现柑橘基因组已经积累了丰富的逆转座子并且这些逆转座子很可能是由病毒或病原菌为媒介在物种间传递而来。而本实验中Bprt1与DQ410750一致性达到70%，这种相似性可能是逆转座子间“横向传递”的结果，这为研究物种的起源、进化途径提供了依据。

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