Fgfr2 S252W突变小鼠下颌切牙改变的研究

周霞，王金川，蒲东全，行勇军，安建平，刘鲁川，邓蔓菁

Fgfr2 S252W突变小鼠下颌切牙改变的研究

周霞，王金川，蒲东全，行勇军，安建平，刘鲁川，邓蔓菁

目的对比野生型和成纤维细胞生长因子受体2(Fgfr2)基因S252W突变型小鼠下颌切牙表型的差异，探讨Fgfr2功能获得性突变对小鼠下颌切牙的影响。方法将EⅡa-Cre雄鼠与Fgfr2S252W-neo/+雌鼠交配，子代获得Fgfr2 S252W突变小鼠。在出生后56d(P56)取材进行Micro-CT、HE染色及钙黄绿素荧光双标检测，分别检测下颌切牙的大体形态、组织形态及牙齿矿化速率。结果新生突变小鼠即呈现出短颅畸形，56d时表现更为明显，Micro-CT显示突变小鼠的下颌切牙伸长及反畸形明显。HE染色显示突变小鼠成釉细胞、成牙本质细胞数目增多，形态多不规则，内釉上皮、外釉上皮形成的上皮隔皱缩。钙黄绿素荧光双标检测显示突变小鼠牙本质矿化生长速率明显高于对照小鼠。结论Fgfr2 S252W点突变对小鼠下颌切牙的伸长及反畸形有一定促进作用。

受体，成纤维细胞生长因子，2型；突变；切牙；小鼠

Apert综合征为多颅缝早闭所致的综合征，是一种少见的常染色体显性遗传疾病，主要由成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2，Fgfr2)功能获得性突变所致[1]，包括S252W和 P253R两种突变，最早由法国神经学家Apert于1906年报道而命名。其颅面部的临床表现为颅缝早闭所致的头颅畸形，突眼和中面部严重发育不良，此外还有严重的对称性并指(趾)畸形[2-4]；中面部凹陷，腭盖高拱，可有腭裂、牙列拥挤和开，反畸形。Chen等[5]和Wang[6]等分别独立报道了其建立了Fgfr2 S252W突变型小鼠模型，研究人员在研究Fgfr2 S252W点突变小鼠骨组织异常机制的同时，观察到部分小鼠的牙齿特别是可以直视的下颌切牙伸长、反，影响进食。目前有关Fgfr2 S252W突变对骨组织生长发育调控作用的研究较多[7-10]，而对牙发育及功能的影响研究甚少，其机制尚不清楚。本实验对比观察了Fgfr2 S252W突变型与野生型小鼠下颌切牙的表型差异，旨在探讨Fgfr2 S252W点突变与小鼠下颌切牙异常的关系。

1 材料与方法

1.1 Fgfr2 S252W功能获得性点突变小鼠的繁殖与鉴定 Fgfr2 S252W功能获得性点突变小鼠从美国国立卫生研究院(NIH)引入后，将雌性带neo基因+突变Fgfr2的基因工程小鼠和雄性EⅡa-Cre小鼠交配，在子代中获得约1/4数量的Fgfr2 S252W功能获得性突变小鼠。在纳入实验前，提取小鼠脚趾DNA进行PCR基因型鉴定，按照基因型分为对照型(+/+)和突变型(S252W/+)两组。以上小鼠均在第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心SPF级动物室分笼饲养，给予12h:12h节律光照，室温22℃，湿度50%～55%，自由进食、饮水。经第三军医大学实验动物管理委员会许可[执行标准SYXK(军2002032)]对实验动物进行操作。

1.2 基因型鉴定 提取小鼠脚趾基因组DNA，采用引物R2-I6F1：5'-TAGGTAGTCCATAACTCGG-3'和R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATGTGGGGC-3'鉴定Fgfr2 S252W点突变小鼠。使用rTaq PCR试剂盒进行PCR扩增，反应体系总体积为25μl。突变基因型为双条带(460bp和520bp)，对照组野生型为单条带(460bp)。

1.3 出生后56d(P56)突变小鼠与同窝野生对照小鼠取材检测

1.3.1 Micro-CT 本实验所用显微CT为美国GE公司开发的explore Locus SP型产品。扫描参数如下：电压80kV，电流80μA，扫描方式360°旋转，扫描时间270min，平均4帧，角度增益0.4°，曝光时间3000ms，分辨率7.0μm×7.0μm×7.0μm。以Flur方式进行扫描，同时扫描标准体模，以备CT值校正。

1.3.2 HE染色 新鲜取材单侧完整下颌骨(含牙)的组织经4%多聚甲醛(PFA)4℃固定过夜，0.5mol/L EDTA脱钙14～20d，流水冲洗过夜。梯度乙醇脱水(70%、80%、90%、100%、100%各1h)，二甲苯透明(2次各30min)。石蜡包埋，制备5μm切片，37℃干燥过夜。常规行HE染色。

1.3.3 钙黄绿素(calcein)荧光双标检测矿化沉积率(mineral apposition rate，MAR) 选取同窝突变型和野生型小鼠8对，P18和P23腹腔注射钙黄绿素(25mg/kg，Sigma-Aldrich)。2d后处死小鼠，解剖分离包含牙列的单侧完整下颌骨。系列乙醇4℃脱水，塑化剂溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ浸透包埋，至完全凝固。5μm冠状切片，通过第一磨牙近中面，做持续萌出切牙的纵断切面。荧光显微镜下观察，拍片。激发波长为485nm，发射波长510nm。采用专业图像分析软件(Image-Pro Plus，IPP)计量分析2条荧光带之间的平均距离，所得值除以标记间隔日数即为MAR，单位为μm/d。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，正态分布的样本数据两组间比较采用t检验，非正态分布的数据比较采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 突变小鼠基因型鉴定结果 突变小鼠基因型鉴定电泳图见图1，双条带为突变基因型，单条带为对照组野生型。

图1 两组小鼠基因型鉴定电泳图Fig.1 Electrophoregram of genotype identification of two groups of mice

2.2 小鼠大体观察及Micro-CT头颅侧面观 新生突变小鼠(1d)身材短小，呈现出短颅圆颅畸形；56d时，圆颅表现更为明显，Micro-CT显示突变小鼠下颌切牙伸长及反畸形较为明显(图2)。

图2 两组小鼠大体观察及Micro-CT头颅侧面观Fig.2 General view and Micro-CT side view of head in two groups of mice

2.3 小鼠下颌切牙HE染色结果 HE染色显示，对照小鼠成釉细胞、成牙本质细胞呈高柱状，排列整齐，细胞核位于细胞基底部；突变小鼠成釉细胞、成牙本质细胞数目增多，形态多不规则，细胞核界限不清楚，无极性，排列紊乱，且突变小鼠下颌切牙颈环缩小，内釉上皮、外釉上皮细胞及星网状层细胞均减少，内釉上皮、外釉上皮形成的上皮隔皱缩(图3)。

图3 两组小鼠下颌切牙的HE染色结果(右侧小图为对应左侧局部放大图)Fig.3 HE staining of mandibular incisors of two groups of mice

2.4 小鼠牙本质荧光双标检测结果 钙黄绿素荧光双标检测显示，突变小鼠与对照小鼠MAR分别为1.22±0.14μm/d、0.93±0.13μm/d，突变小鼠牙本质矿化生长速率明显高于对照小鼠，差异有统计学意义(P＜0.05，图4)。

图4 两组小鼠牙本质荧光双标图(P56)Fig.4 Double fluorescence labelling of dentin of two groups of mice

3 讨 论

为克服Apert综合征患者病例少，年龄、遗传背景差异大，以及缺乏相似背景正常对照人群的不足之处，最早由Chen等[5]所在实验室用基因敲入技术建立了基于Cre-LoxP系统的模式动物——模拟人Apert综合征的小鼠模型(Fgfr2 S252W突变引起)。为了解该模型小鼠的头颅发育畸形是否与人类Apert综合征类似，杜晓兰等[11]用客观、定量的欧几里得矩阵分析法(Euclidean distance matrix analysis，EDMA)分析了该小鼠的头颅形态结构特点，发现该Apert小鼠有穹隆状头颅、牙颌轻度前向错位、眼距增宽和面部发育不良等头颅形态特征，表明该小鼠模型在头颅形态结构上较真实地模拟了人类Apert综合征的头颅表型特征。本实验按照Chen等[5]的方法繁殖的突变小鼠头颅畸形也具有与人类Apert综合征患者相似的头颅表征，其中下颌切牙伸长、反尤为明显。

尹良军等[12-13]对Fgfr2 S252W增强型点突变小鼠骨髓基质细胞进行体外培养诱导成骨实验发现，Fgfr2功能持续增强可能抑制未分化的间充质细胞向成骨细胞系的早期分化，但是促进成骨细胞的分化；突变型小鼠长骨骨折愈合过程中，骨痂中软骨组织形成的时间明显延迟，软骨组织钙化、编织骨形成受阻，软骨骨痂长期存在，软骨内成骨受到抑制，从而导致骨骼发育过程中膜内骨化过程异常和软骨内骨化过程受到抑制，这两者的协同作用构成了Apert综合征多个重要骨骼异常体征的发病机制。由此可见，Fgfr2 S252W突变通过对成骨细胞和软骨细胞的作用而抑制骨的生长发育，但本实验观察到的下颌切牙过度生长也是突变的促进作用所致。骨和牙同为机体硬组织，同一突变却起到了相反的作用，其中的机制与联系还有待进一步深入研究。

以往研究显示，在牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状期等，FGFs/FGFR2都发挥正常的调控作用，一旦FGFR2功能增强，失去平衡，势必会影响牙齿的正常发育。本实验中Fgfr2 S252W突变小鼠下颌切牙根尖上皮隔皱缩，根尖孔变大，血供营养相对丰富，促进前成牙本质细胞、前成釉细胞向成牙本质细胞、成釉细胞分化，可能造成了HE染色结果中成牙本质细胞、成釉细胞数目增多以及大体观察中突变小鼠下颌切牙生长过快导致的伸长及反现象，提示Fgfr2 S252W突变对小鼠下颌切牙的生长期有调控作用，但对早期牙胚(蕾状期、帽状期、钟状期)发育的调控机制如何，还有待进一步研究。

建立疾病小鼠模型的目的是研究疾病发生机制及寻找治疗措施。在前期研究中，Chen等[5]发现Fgfr2 S252W突变所致的Apert综合征头颅异常主要与颅骨成骨细胞分化、凋亡异常有关。理论上讲，可以通过纠正这些异常来缓解Apert综合征的颅骨发育畸形，但这些措施往往缺乏细胞靶向性，且有的措施如抑制细胞凋亡等因为可能存在潜在的致癌性等而难以应用。由于Apert综合征的最根本原因是FGFR2突变后功能增强，提示只要降低或阻断增强的FGFR2信号就可从源头上消除病因，达到缓解或治疗Apert综合征切牙长冠、反畸形的目的。2007年Shukla等[14]通过小鼠间交配将建立的针对Fgfr2 S252W突变的RNAi转基因引入Fgfr2 S252W点突变小鼠，结果发现该小鼠头颅畸形基本消失。虽然该法是通过遗传交配实现，在临床上不可行，但其实验结果除提示可针对功能增强型点突变所致遗传病进行RNAi治疗外，也进一步证明可通过降低FGFR2信号强度来缓解和治疗Apert综合征引起的头颅畸形，下颌切牙伸长及反畸形也可得到改善。

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Changes of mandibular incisor in Fgfr2 S252W mutant mice

ZHOU Xia1, WANG Jin-chuan1, PU Dong-quan2, XING Yong-jun1, AN Jian-ping1, LIU Lu-chuan1, DENG Man-jing1*
1Department of Stomatology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
2Medical Team, The No.77289 Army of PLA, Kunming 650225, China
*

, E-mail: iradeng@163.com
This work was supported by the Natural Science Foundation Project of Chongqing (2009AC5019, 2011BA5013)

ObjectiveTo compare the phenotypic differences of mandibular incisor between the wild-type mice and fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) gene S252W mutant mice, and explore the influence of gain-of-function mutation in Fgfr2 gene on mandibular incisors in mice.MethodsThe male EⅡa-Cre mice were mated with Fgfr2S252W-neo/+females to obtain the Fgfr2 S252W mutant mice. On the 56th day after offspring's birth (P56), samples were taken for Micro-CT, HE staining and calcein double fluorescent labeling to observe the gross appearance, tissue morphology and mineral apposition rate of mandibular incisors, respectively.ResultsThe newborn mutant mice showed short cranial deformity, which became more obvious on P56. Micro-CT showed a significant elongation and cross-bite deformity of mandibular incisors. HE staining showed that there were more ameloblasts and odontoblasts in the mutant mice, mostly with irregular appearance; epithelial diaphragm composed of inner and outer enamel epithelium shrank. Calcein double fluorescent labeling showed that the mineral apposition rate of dentin in mutant mice was significantly higher than that in controls.ConclusionFgfr2 S252W mutation accelerates the growth of mandibular incisors in mice, resulting in the elongation and cross-bite deformity of mandibular incisors.

receptor, fibroblast growth factor, type 2; mutation; incisor; mice

R780.2

A

0577-7402(2013)10-0807-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.005

2013-03-15；

2013-07-13)

(责任编辑：张小利)

重庆市自然科学基金(2009AC5019，2011BA5013)

周霞，医学博士。主要从事牙体牙髓牙周病的研究

400042 重庆 第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科(周霞、王金川、行勇军、安建平、刘鲁川、邓蔓菁)；650225 昆明 解放军77289部队卫生队(蒲东全)

邓蔓菁，E-mail：iradeng@163.com